基于分光光度法快速檢測果蔬中的擬除蟲菊酯類農藥殘留

◎ 何麗媛，倪樹標，武悅俊，張紅剛

（廣東省科學院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學測量與應急檢測技術重點實驗室，廣東省食品營養與安全快速檢測儀器工程技術研究中心，廣東 廣州 510070）

我國是一個農業生產大國，蔬菜水果產量大，但生產方式主要以農戶分散種植為主，往往存在盲目使用、過量使用、不按安全間隔期使用農藥等不規范情況，從而造成了蔬菜水果中的農藥殘留問題[1]。調查表明，檢出率較高的農藥主要為擬除蟲菊酯類、有機磷類和氨基甲酸酯類農藥[2-4]。由于蔬菜水果的產量大、生產分散、銷售期短，且專業技術強、成本高、檢測時間長，實驗室檢測技術根本無法滿足蔬菜水果的全面監測，因此農藥殘留快速檢測技術是我國食品安全監管的主要技術手段。而擬除蟲菊酯類農藥已成為第二大類除蟲劑，其使用量約占所有農藥使用量的1/4[5]，且其對哺乳動物具有神經毒性，對生殖系統、心血管系統、免疫系統也都有毒害作用[6-8]。因此研究擬除蟲菊酯類農藥殘留的快速檢測方法，對進一步實施食用農產品的全面監測具有重要意義。

酶抑制法是根據農藥對酶的抑制作用來測定農藥的殘留量，農藥殘留量越大，產生的抑制作用越強，酶水解底物的能力越弱。李玉蘭[9]研究發現多種擬除蟲菊酯類農藥對特定羧酸酯酶均具有明顯抑制作用。羧酸酯酶（Carboxlesterase，CaEs，EC3.1.1.1）屬于α/β折疊水解酶家族，在水存在的條件下能夠水解代謝帶羧基的酯[10]。它在哺乳動物體內分布廣泛，主要存在于肝臟和血清中。羧酸酯酶對α-乙酸萘酯具有較高的水解活性，其水解產物α-萘酚與顯色劑固藍B鹽偶氮化反應生成紅色物質，反應式如圖1所示[11]。

圖1 羧酸酯酶對α-乙酸萘酯的水解及顯色反應式圖

本文選用豬肝羧酸酯酶作為工作酶，α-乙酸萘酯為反應底物，固藍B鹽為顯色劑，十二烷基硫酸鈉（SDS）為終止劑，加入擬除蟲菊酯類農藥殘留抑制豬肝羧酸酯酶，利用分光光度法測定酶的活性變化，利用擬除蟲菊酯類農藥對豬肝羧酸酯酶的抑制效果，從而快速檢測果蔬中的擬除蟲菊酯類農藥殘留。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

豬肝羧酸酯酶（3.5 KU），SIGMA-ALDRICH；α-乙酸萘酯（≥98%）、固藍B鹽、α-萘酚，北京伊諾凱科技有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)，西亞試劑；聯苯菊酯標準品（≥99.3%），廣州佳途科技股份有限公司；甲氰菊酯標準品（≥99%），中國計量科學研究院；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、濃鹽酸（12 mol·L-1）、無水乙醇，廣州化學試劑廠。

1.1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計（島津UV-2450），島津；多功能食品安全檢測儀（GC-600E），中國廣州分析測試中心；萬分位天平（BSM220.4），上海卓精電子科技有限公司；pH計（雷磁PHS-3G），上海儀電科學儀器；電熱恒溫水浴鍋，北京精科華瑞儀器有限公司；渦旋混勻器（XK80-A），江蘇新康醫療器械有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液的配制

（1）PBS（pH=6.5）。分別稱取11.9 g無水磷酸氫二鈉和3.2 g磷酸二氫鈉，加入蒸餾水溶解定容至1 000 mL，使用pH計緩慢加入6 mol·L-1鹽酸調節pH=6.5。

（2）酶液。稱取10 mg豬肝羧酸酯酶，PBS溶解并定容至10 mL，配置成1 mg·mL-1酶儲存液，4 ℃冰箱保存，臨用前用PBS稀釋至所需濃度。

（3）底物。稱取0.285 0 g α-乙酸萘酯溶于無水乙醇，并定容至100 mL得到0.015 mol·L-1α-乙酸萘酯溶液；臨用前用無水乙醇稀釋至所需濃度；底物現配現用。

（4）顯色劑。稱取50 mg固藍B鹽溶于蒸餾水，并定容至10 mL，配制成0.5%固藍B鹽儲存溶液，避光并放置4 ℃冰箱保存；臨用前用蒸餾水稀釋至所需濃度。

（5）終止劑。稱取10 g SDS溶解于40 g蒸餾水中配制成20% SDS溶液，移取2.5 mL、5 mL、7.5 mL 20% SDS溶液稀釋定容至10 mL制備成5%、10%、15% SDS溶液。

（6）α-萘酚系列標準溶液的配制。稱取0.144 g α-萘酚溶于丙酮，并定容至10 mL，得到0.1 mol·L-1α-萘酚溶液；移取 100 μL 0.1mol·L-1α-萘酚溶液使用丙酮稀釋定容至10 mL，得到1×10-3mol·L-1α-萘酚溶液；臨用前用丙酮稀釋至所需濃度。

（7）聯苯菊酯標準溶液的配制。稱取10 mg聯苯菊酯溶于甲醇，并定容至10 mL，配制成1 mg·mL-1聯苯菊酯標準溶液；移取800 μL 1 mg·mL-1聯苯菊酯標準溶液，使用甲醇稀釋定容至100 mL，得到8 μg·mL-1聯苯菊酯儲備液；臨用前用甲醇稀釋至所需濃度。

（8）甲氰菊酯標準溶液的配制。稱取10 mg甲氰菊酯溶于甲醇，并定容至10 mL，配制成1 mg·mL-1甲氰菊酯標準溶液；移取800 μL1 mg·mL-1甲氰菊酯標準溶液，使用甲醇稀釋定容至100 mL，得到8 μg·mL-1甲氰菊酯儲備液；臨用前用甲醇稀釋至所需濃度。

（9）6 mol·L-1鹽酸。濃鹽酸（12 mol·L-1）與蒸餾水1∶1混合。

1.2.2 產物最大吸收波長的確定

在紫外可見分光光度計400～700 nm掃描α-萘酚與顯色劑固藍B鹽偶氮化反應生成紅色物質的吸收光譜，確定水解產物α-萘酚用分光光度法的最佳測定波長。

1.2.3 終止劑SDS的確定

分 別 移 取 4.0 mL PBS、0.25 mL 4×10-4mol·L-1α-萘酚標準工作溶液加入離心管中混合均勻，然后加入0.25 mL不同濃度的終止劑（0%、5%、10%、15%和20%的SDS），0.25 mL顯色劑（固藍B鹽），渦旋混勻30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1鹽酸，搖勻后吸取3 mL待測液于比色皿中，放入多功能食品安全檢測儀中，在最佳檢測波長下測定吸光度值，確定終止劑的最佳濃度。

1.2.4 顯色劑固蘭B鹽的確定

分別移取4.0 mL PBS、0.25 mL α-萘酚標準工作溶液加入離心管中混合均勻，然后加入0.25 mL終止劑（SDS），0.25 mL不同濃度顯色劑（0.03%、0.04%、0.05%和0.06%固蘭B鹽），渦旋混勻30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1鹽酸，搖勻后吸取3 mL待測液于比色皿中，放入多功能食品安全檢測儀中，在最佳檢測波長下測定吸光度值，確定顯色劑的最佳濃度。

1.2.5 α-萘酚顯色反應標準曲線

分別移取4.0 mL PBS、0.25 mL系列α-萘酚標準工作溶液加入離心管中混合均勻，然后加入0.25 mL終止劑（SDS），0.25 mL顯色劑（固藍B鹽），渦旋混勻30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1鹽酸，搖勻后吸取3 mL待測液于比色皿中，放入多功能食品安全檢測儀中，在最佳檢測波長下測定吸光度值，繪制α-萘酚顯色反應的標準曲線。

1.2.6 底物最佳濃度的確定

分別移取 50 μL 4 μg·mL-1酶液、3.95 mL PBS、0.25 mL 不同濃度底物（0 mol·L-1、3×10-4mol·L-1、7.5×10-4mol·L-1及 15×10-4mol·L-1α-乙酸萘酯）加入離心管中混合均勻，在40 ℃水浴中加熱15 min，然后加入0.25 mL終止劑（SDS），0.25 mL顯色劑（固藍B鹽），渦旋混勻30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1鹽酸，搖勻后吸取3 mL待測液于比色皿中，放入多功能食品安全檢測儀中，在最佳檢測波長下測定吸光度值，確定最佳底物濃度。

1.2.7 酶液最佳濃度的確定

分別移取 50 μL 不同濃度酶液（0 μg·mL-1、1 μg·mL-1、3 μg·mL-1、5 μg·mL-1及 7 μg·mL-1豬 肝 羧 酸 酯）、3.95 mL PBS、0.25 mL底物（α-乙酸萘酯）加入離心管中混合均勻，在40 ℃水浴中加熱15 min，然后加入0.25 mL終止劑（SDS），0.25 mL顯色劑（固藍B鹽），渦旋混勻30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1鹽酸，搖勻后吸取3 mL待測液于比色皿中，放入多功能食品安全檢測儀中，在最佳檢測波長下測定吸光度值，確定最佳酶液濃度。

1.2.8 最佳反應溫度的確定

分別移取50 μL酶液（豬肝羧酸酯）、3.95 mL PBS、0.25 mL底物（α-乙酸萘酯）加入離心管中混合均勻，在不同溫度下（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃以及60 ℃）水浴加熱15 min，然后加入0.25 mL終止劑（SDS），0.25 mL顯色劑（固藍B鹽），渦旋混勻30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1鹽酸，搖勻后吸取3 mL待測液于比色皿中，放入多功能食品安全檢測儀中，在最佳檢測波長下測定吸光度值，確定最佳反應溫度。

1.2.9 最佳顯色反應時間的確定

分別移取50 μL酶液（豬肝羧酸酯）、3.95 mL PBS、0.25 mL底物（α-乙酸萘酯）加入離心管中混合均勻，在最佳反應溫度下水浴加熱15 min，然后加入0.25 mL終止劑（SDS），0.25 mL顯色劑（固藍B鹽），渦旋混勻，顯色反應不同的時間（15 s、30 s、60 s、90 s以及120 s），加入0.25 mL的6 mol·L-1鹽酸，搖勻后吸取3 mL待測液于比色皿中，放入多功能食品安全檢測儀中，在最佳檢測波長下測定吸光度值，確定最佳顯色反應時間。

1.2.10 擬除蟲菊酯類農藥對酶的抑制效果

分別移取50 μL酶液（豬肝羧酸酯）、3.7 mL PBS、0.25 mL不同濃度的擬除蟲菊酯類農藥標準工作液（聯苯菊酯或甲氰菊酯）加入離心管中，混合均勻，渦旋30 s，靜置10 min；加入0.25 mL底物（α-乙酸萘酯）混合均勻，在最佳反應溫度下水浴加熱15 min，然后加入0.25 mL終止劑（SDS），0.25 mL顯色劑（固藍B鹽），渦旋混勻30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1鹽酸，搖勻后吸取3 mL待測液于比色皿中，放入多功能食品安全檢測儀中，在最佳檢測波長下測定吸光度值，測定聯苯菊酯對酶的抑制效果。

2 結果與分析

2.1 產物最大吸收波長的測定

按1.2.2方法進行測定，結果見圖2。

圖2 α-萘酚與固藍B鹽顯色反應的吸收光譜圖

由圖2可知，羧酸酯酶水解底物（α-乙酸萘酯）生成的水解產物α-萘酚與顯色劑固藍B鹽偶氮化反應生成紅色物質在536.6 nm處有最大吸收峰，因此選擇536 nm為分光光度法檢測水解產物α-萘酚的最佳測定波長。

2.2 終止劑SDS的確定

按1.2.3方法進行測定，結果見圖3。

圖3 不同濃度SDS對顯色產物的影響圖

據文獻報道，終止劑SDS的作用是裂解肽鏈，從而使催化水解的豬肝羧酸酯酶失活，讓水解反應終止，同時SDS的加入會影響顯色產物的穩定性[11-12]。實驗顯示，SDS濃度為0時，α-萘酚與固藍B鹽的顯色產物開始為紅色，但很快顏色就退去，且溶液中析出灰黑色絮狀物，吸光度值偏低。而隨著SDS濃度的不斷增加，顯色產物的吸光度值逐漸升高，顯色情況也越來越穩定，SDS濃度達到15%吸光度值趨于平緩。因受限于SDS溶解度，濃度為20%以上的SDS溶液放置一段時間后容易析出，因此選擇更穩定的15%SDS溶液為最佳的終止劑。

2.3 顯色劑固蘭B鹽的確定

按1.2.4方法進行測定，結果見圖4。

圖4 不同濃度顯色劑對顯色產物的影響圖

顯色劑的用量也是影響顯色穩定性的重要因素。顯色劑濃度越大時，顏色的蛻變越明顯，顯色劑濃度太小容易造成顯色不足。固藍B鹽與α-萘酚發生偶氮化反應，擴大共軛體系，生成顯色產物。由圖4可知，0.05%以上的固蘭B鹽與水解產物α-萘酚的顯色反應穩定并有良好的線性關系。因此過量的固蘭B鹽有利于反應的穩定性，而固藍B鹽見光易分解，因此選擇0.06%的固藍B鹽為最佳濃度的顯色劑。

2.4 α-萘酚顯色反應標準曲線

將 不 同 濃 度 的 0 mol·L-1、0.5×10-4mol·L-1、1×10-4mol·L-1、2×10-4mol·L-1、4×10-4mol·L-1以 及6×10-4mol·L-1α-萘酚標準工作溶液按1.2.5的方法進行測定，結果見圖5和圖6。

圖5 不同濃度α-萘酚標準溶液與固藍B鹽的顯色反應情況圖

圖6 α-萘酚顯色反應標準曲線圖

由圖5和圖6可知，水解產物α-萘酚與顯色劑固藍B鹽顯色反應生成的紅色物質隨著α-萘酚濃度的增大而顏色加深，且在0～6×10-4mol·L-1α-萘酚標準工作溶液濃度范圍內，與吸光度值成線性相關，R2=0.999 6。

2.5 底物最佳濃度的確定

按1.2.6的方法進行測定，結果見圖7。

圖7 不同濃度α-乙酸萘酯的顯色反應圖

由圖7可知，隨著底物α-乙酸奈酯濃度的不斷增加，顯色產物的吸光度值也隨之上升，當α-乙酸奈酯濃度超過7.5×10-4mol·L-1時，吸光度值隨著底物濃度的增加變化不大，因此選擇α-乙酸萘酯的最佳反應濃度為 7.5×10-4mol·L-1。

2.6 酶液最佳濃度的確定

按1.2.7方法進行測定，結果見圖8。

由圖8可知，隨著豬肝羧酸酯酶濃度的增加而顯色產物吸光度值也增大，且為線性相關，R2=0.995 8，選擇吸光度值為0.8以上即豬肝羧酸酯酶濃度為5 μg·mL-1為最佳酶液濃度。

圖8 不同濃度的豬肝羧酸酯酶的顯色反應圖

2.7 最佳反應溫度的確定

按1.2.8方法進行測定，結果見圖9。

圖9 不同水浴溫度的顯色反應圖

溫度對酶的活力有較大影響，從圖9可知，溫度升高，豬肝羧酸酯酶的酶活力逐漸升高，在45 ℃時達到最高，水解底物后生成的顯色物質吸光度值最大，而后隨著溫度繼續升高，酶活力反而有所下降，因此選擇45 ℃為最佳反應溫度。

2.8 最佳顯色反應時間的確定

按1.2.9方法進行測定，結果見圖10。

圖10 不同顯色反應時間的顯色反應圖

顯色反應時間會影響水解產物α-萘酚和固藍B鹽的顯色反應完全程度。由圖10可知，15 s顯色反應時間過短，顯色反應未能完全進行，超過30 s后，顯色反應時間過長，顯色產物不穩定導致吸光度值有所下降。據文獻報道，顯色產物穩定存在于酸性環境中，故在顯色反應完成后需在溶液中加入6 mol·L-1鹽酸將溶液pH調節到酸性，使顯色產物穩定不變[11]。顯色反應時間加長，將延長加入6 mol·L-1鹽酸調節pH的時間，導致顯色產物不穩定發生褪色現象，因此選擇30 s為最佳顯色反應時間。

2.9 擬除蟲菊酯類農藥對酶的抑制效果

按1.2.10方法進行測定，加入0.25 mL聯苯菊酯或甲氰菊酯標準工作液 1.6 μg·mL-1、3.2 μg·mL-1、4.8 μg·mL-1、6.4 μg·mL-1以及 8 μg·mL-1，使混合溶液中聯苯菊酯或甲氰菊酯標準溶液濃度為0.1 μg·mL-1、0.2 μg·mL-1、0.3 μg·mL-1、0.4 μg·mL-1以及 0.5 μg·mL-1，結果見圖11和圖12。

圖11 聯苯菊酯對酶的抑制效果圖

圖12 甲氰菊酯對酶的抑制效果圖

由圖11和圖12可知，當聯苯菊酯和甲氰菊酯濃度達到0.1 μg·mL-1時即對豬肝羧酸酯酶產生了明顯的抑制效果，且隨著聯苯菊酯和甲氰菊酯標準溶液濃度的增加，抑制效果更顯著，顯色產物逐漸減少，吸光度值下降，當聯苯菊酯濃度達到0.3 μg·mL-1、甲氰菊酯濃度達到0.4 μg·mL-1時，抑制程度達到最大。因此擬除蟲菊酯類農藥對豬肝羧酸酯酶有明顯的抑制效果，能影響豬肝羧酸酯酶催化α-乙酸萘酯水解的能力，使水解產物減少并無法與固藍B鹽形成顯色產物。

3 結論

通過紫外可見分光光度計在400～700 nm光譜掃描發現，豬肝羧酸酯酶水解底物α-乙酸萘酯的水解產物α-萘酚與固藍B鹽顯色反應的產物在536 nm處有最大吸收峰；通過優化終止劑和顯色劑濃度，在終止劑為15% SDS和顯色劑為0.06%固藍B鹽條件下，水解產物α-萘酚能與固藍B鹽生產穩定的紅色顯色產物，且在α-萘酚0～6×10-4mol·L-1范圍內與顯色產物吸光度值成線性相關，R2=0.999 6。因此在536 nm最佳測定波長下，可以用分光光度法檢測豬肝羧酸酯酶水解底物α-乙酸萘酯后與固藍B鹽的顯色反應。

通過優化酶水解顯色反應的關鍵因素包括底物、酶液、反應溫度和顯色反應時間等，建立基于分光光度法的擬除蟲菊酯類農藥殘留快速檢測方法，以酶液為 5 μg·mL-1豬肝羧酸酯酶、底物為 7.5×10-4mol·L-1、終止劑為15%SDS、顯色劑為0.06%固藍B鹽、pH調節劑為6 mol·L-1鹽酸，在536 nm波長下檢測顯色產物的吸光度值，當聯苯菊酯和甲氰菊酯濃度達到0.1 μg·mL-1時即對豬肝羧酸酯酶產生了明顯的抑制效果，擬除蟲菊酯類農藥使豬肝羧酸酯酶降低了催化α-乙酸萘酯水解的能力，導致水解產物減少并無法與固藍B鹽形成顯色產物，吸光度值降低。該方法操作簡單，適宜基層人員現場操作，滿足快速檢測的需求。