糧食中嘔吐毒素的檢測能力驗證結果分析

◎ 劉天左，戚培培，周 露，王 林，張冰清

（國家有機食品質量監督檢驗中心（江蘇），江蘇 揚州 225800）

嘔吐毒素，又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，縮寫DON），化學名稱3α,7α,15-三羥基-12,13-環氧單端孢霉-9-蒽-8-酮，屬單端孢霉稀族化合物。嘔吐毒素是鐮刀菌屬的菌種引起的谷物赤霉病的重要指示性毒素，因其可引起豬的嘔吐而得名嘔吐毒素[1-2]。嘔吐毒素的污染狀況與產生毒素的毒株、溫度、濕度、通風以及日照等因素有關。嘔吐毒素屬于劇毒或中等毒物，當人攝入了被嘔吐毒素污染的食物后，可能會導致嘔吐、腹瀉、頭疼以及頭暈等以消化系統和神經系統為主的中毒癥狀，嚴重時損害造血系統造成死亡，其慢性毒性對胃癌細胞、免疫系統有一定影響，且有明顯胚胎毒性和一定致畸作用。由于中國傳統飲食習慣中糧谷比例大大高于西方，使得嘔吐毒素的危害尤為突出。1998年，在國際癌癥研究機構公布的評價報告中，嘔吐毒素被列為3類致癌物[3]。因此，對嘔吐毒素的檢測關系到糧食、食品、飼料多個領域的安全問題。

目前，我國現行國家標準《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）規定谷物及其制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的限量為1 000 μg·kg-1，《飼料衛生標準》（GB 13078—2017）規定植物性飼料原料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的限量為5 mg·kg-1。目前，嘔吐毒素的常見的檢測方法有薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、柱凈化法結合電子捕獲檢測器的氣相色譜法（GC/ECD）、高效液相色譜串聯質譜法（HPLC-MS/MS）、放射性免疫測定法（RIA）以及酶聯免疫吸附篩查法（ELISA）等[4]。而此次能力驗證本實驗采用的方法是免疫親和層析凈化高效液相色譜法。

能力驗證是指利用實驗室間比對，按照預先制定的計劃來評價參加者的一項外部質量控制活動。參加能力驗證不僅能夠確認實驗室自身的技術能力，還能通過與外部實驗室的橫向比對，發現實驗室自身存在的問題并加以整改，以進一步提升檢測能力[5]。本次實驗室參加的能力驗證計劃由國家市場監督管理總局組織，大連海關技術中心負責協調及實施。參加本次能力驗證目的是了解和評價本實驗室對糧食及食品中嘔吐毒素含量檢測的能力和水平，促進和提升本實驗室檢測糧食及食品中嘔吐毒素的技術能力和水平，規范實驗室管理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米粉，4份：由大連海關技術中心提供的能力驗證樣品，計劃編號CNCA-21-03，樣品編號分別為39906、54202、03311、17610，其中39906號和54202號用于檢驗能力評估，03311號和17610號為干擾樣品。質控樣品：玉米粉中嘔吐毒素含量檢測質控樣品（1.4±0.4）mg·kg-1，k=2，大連海關技術中心。

甲醇，色譜級，上海安譜實驗科技股份有限公司；聚乙二醇（相對分子質量為8 000；阿拉丁）；玻璃纖維濾紙（WHATMAN）；嘔吐毒素免疫親和柱（ROMER DON StarTM)；磷酸鹽緩沖溶液（以下簡稱PBS）：稱取8.00 g氯化鈉、1.20 g磷酸氫二鈉、0.20 g磷酸二氫鉀、0.20 g氯化鉀，用900 mL水溶解，調pH=7.0，用水定容到1 000 mL；標準溶液標準品：嘔吐毒素（1ST7213-100A-S070305，First Standand）。

1.2 儀器與設備

液相色譜儀配二極管陣列檢查器（Agilent 1200，美國安捷倫）；C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司）；混合圓周振蕩器（KS-60，德國IKA）；高速離心機（BIOFUGE STRATOS，Thermo Fisher）。

1.3 實驗方法

1.3.1 檢測方法

按照《食品安全國家標準 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》（GB 5009.111—2016）第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法[6]，并參照作業指導書要求。

1.3.2 標準溶液配制

吸取1 mL嘔吐毒素標準品（100 μg·mL-1）于10 mL容量瓶中，用甲醇-水（20∶80，V/V）定容為10 μg·mL-1的標準物質使用液，吸取標準物質使用液0.1 mL、0.4 mL、1 mL、2 mL、5 mL分別到10 mL容量瓶中用甲醇 -水（20∶ 80，V/V）定容，得到 0.1 μg·mL-1、0.4 μg·mL-1、1 μg·mL-1、2 μg·mL-1、5 μg·mL-1標準系列溶液。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：C18，4.6 mm×150 mm，5 μm；柱溫：35 ℃；流動相：甲醇-水（20∶80，V/V）；流速：1 mL·min-1；進樣量：50 μL；檢測器：二極管陣列檢測器（DAD）；檢測波長：218 nm。

1.3.4 樣品提取

稱取25 g左右玉米粉樣品于100 mL具塞三角瓶中，加入5 g聚乙二醇，加100 mL水，混勻，混合圓周振蕩器振蕩20 min，以玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清，收集濾液于干凈的離心管中，10 000 r·min-1離心5 min。

1.3.5 樣品凈化

事先將低溫下保存的免疫親和柱恢復至室溫，待免疫親和柱內原有液體流盡后，準確移取上述濾液2.0 mL于免疫親和柱中。調節下滴速度，控制樣液以每秒1滴的流速通過免疫親和柱，直至空氣進入親和柱中。用5 mL PBS緩沖鹽溶液和5 mL水先后淋洗免疫親和柱，流速約為每秒1～2滴，直至空氣進入親和柱中，棄去全部流出液，抽干小柱。準確加入2 mL甲醇洗脫親和柱，控制每秒1滴的下滴速度，收集全部洗脫液至試管中，在50 ℃下用氮氣緩緩地將洗脫液吹至近干，加入1.0 mL甲醇-水（20∶80，V/V）溶液，渦旋30 s溶解殘留物，0.45 μm濾膜過濾，收集濾液于進樣瓶中以備進樣。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

根據預試驗選擇濃度線性范圍為0.1～5 μg·mL-1，將嘔吐毒素標準系列溶液按照濃度由低到高依次注入液相色譜儀，以目標物嘔吐毒素的濃度（μg·mL-1）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。濃度與峰面積呈現良好的線性關系，線性方程為y=53.764 68x+1.073 46，相關系數為0.999 92。標準曲線見圖1。

圖1 嘔吐毒素標準曲線圖

2.2 質控樣品測定

為驗證方法的可靠性，稱取玉米粉質控樣按照上述實驗條件測定玉米粉質控樣品中嘔吐毒素的含量。質控樣品平行進樣2次，測定結果見表1。檢測結果在質控范圍內，滿足實驗要求。

表1 質控樣品測定結果表

2.3 能力驗證結果

測試結果以μg·kg-1為單位上報，保留到小數點后一位，每份樣品重復測定兩次，取平均值。樣品編號分別為 39906、54202、03311、17610，其中 39906號和54202號用于檢驗能力評估，03311號和17610號為干擾樣品，嘔吐毒素能力驗證報告也給出了干擾樣品的Z值參考。

能力驗證結果見表2。能力驗證評定原則為|Z|小于3時，參加機構的結果合格，因此根據嘔吐毒素能力驗證結果報告給出的本實驗室結果的Z值，本次能力驗證結果為合格。

表2 嘔吐毒素能力驗證結果表

3 結論與討論

對能力驗證結果影響的因素有很多，實驗前應充分考慮到人、機、料、法、環及測各個環節對測定結果的影響，安排經驗豐富的實驗人員進行試驗，本次嘔吐毒素測定時要注意以下幾方面。

（1）收到樣品后應該避光密封保存，開封后，應該旋緊封蓋，并置于密封袋中，防止樣品被污染。

（2）標準物質在定量分析中有至關重要的作用，本次實驗室參加能力驗證使用了有證標準物質，純度符合要求定量時測試樣品濃度落在標準曲線范圍內。

（3）嘔吐毒素樣品前處理過程中主要有兩個方面對結果影響較大，一方面是提取過程，振蕩或超聲的時間一定要夠，如果可以的話，上均質機均值會更好；另一方面是免疫親和柱的選擇，本次實驗采用的是ROMER的DONStarTM免疫親和柱，柱容量高達2 500 ng，因此能完全適用本次能力驗證，如果使用柱容量較小的免疫親和柱，會使測試的結果偏低。

（4）為保證測定結果的準確性，本次能力驗證，實驗室在操作中采用了同時帶質控樣品的形式進行質量控制。

（5）嘔吐毒素有較強的毒性并且是3類致癌物，因此實驗人員在操作時必須進行必要的個人防護，同時妥善處理好試驗后的廢棄物，以防二次污染。