低氧誘導因子1α和長鏈非編碼RNA-SNHG15在腦梗死發生發展中的表達及臨床意義

張晨昕，沈越 ，劉瑞雪，張赫楠，趙陽

1.齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院神經內科三病房，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院泌尿外科病房，黑龍江齊齊哈爾 161000；3.齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院內科，黑龍江齊齊哈爾 161000

腦梗死（cerebral infarction）作為臨床上常見的腦血管疾病，具有極高的致死率與致殘率，并且嚴重的影響著人類的健康生活，其發病率也隨著社會的發展在不斷增長。腦梗死在臨床上又稱為缺血性腦卒中，主要是由各種原因導致的腦部血液循環發生障礙，使腦部組織局部缺血缺氧甚至壞死，而出現的一種神經功能缺損的臨床綜合征[1]。長鏈非編碼RNA是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA[2]，參與各種細胞生命活動的調控，與多種疾病的發生發展關系密切[3]。在前期研究中，發現長鏈非編碼RNA—核仁小RNA宿主基因15（SNGH15）在腦梗死患者的外周血中呈異常高表達，并且在低氧脅迫條件下表達明顯上調，這提示SNGH15可能與腦梗死的發生有著密切關系。低氧誘導因子-1是一種轉錄因子，其在機體抗缺血缺氧方面發揮著重要作用[4]，目前研究表明，低氧誘導因子-1與靶基因特定序列結合從而調控它們的轉錄與表達，并可能參與對低氧反應的信號轉導，以維持機體氧的自我平衡與氧的穩態，從而在缺血缺氧腦損傷中發揮重要作用。2021年7—9月本研究通過制備30只大鼠缺血性腦損傷模型，采用qPCR檢測上述樣本HIF-1α、SNHG15動態表達水平，分析其表達時間關系及表達水平的相關性。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

成年SD大鼠30只，體質量250～280 g，雌雄不限，隨機分為模型組（24只）：接受動脈結扎和斷開手術；假手術組（3只）：只接受動脈分離，并不結扎和斷開動脈，直接縫合；正常對照組（3只）：不接受任何手術。模型組再分為缺血2 h、再灌注4 h、再灌注12 h和再灌注24 h組，每組6只。

1.2 方法

1.2.1 制備大鼠缺血性腦損傷模型 模型建立參照Belayev改良Longa法。在室溫（25℃）條件下，用3.6%的水合氯醛腹腔麻醉動物，在頸部正中做切口，結扎左側頸外動脈遠端，頸總動脈及頸內動脈置動脈瘤夾，斷開左側頸外動脈后插入末端涂有一層1%的左旋多聚賴氨酸的直徑0.25 mm的尼龍線，深度為距頸總動脈分叉處18 mm，2 h后再次麻醉動物并拉出尼龍線。假手術組尼龍線插入深度為15 mm，余步驟相同。手術期間保持大鼠肛溫在36.5～37.5℃。假手術組動脈分離后不結扎不斷開，直接縫合切口。

1.2.2 取材 分別在2、4、12、24 h采集大鼠外周血，在24 h采集大鼠腦缺血區組織。采用qPCR檢測上述樣本低氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α）、SNHG15動態表達水平，分析其表達時間關系及表達水平的相關性。

1.2.3 熒光定量qPCR檢測 按照RNA反轉錄試劑盒說明合成cDNA。使用實時聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）系統進行實時逆轉錄PCR（qPCR）。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）作為內參照，用 2－ΔΔCt方法計算各組樣本的 SNGH15、HIF-1α的相對表達量，實驗重復3次。

1.2.4 TTC染色 將腦組織放入-20℃冰箱速凍20 min，取出后按照實驗要求進行切片，切片后將組織放入2%氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride, TTC）中，并用錫箔紙蓋住，置于37℃溫箱中存放25 min，每5分鐘翻動1次切片。然后用10%甲醛溶液固定，留置過夜，觀察腦組織切片呈色情況。

1.2.5 EMSA檢測 將設置好的探針反應體系加入同位素后，用Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻。使用水浴或者PCR儀，73℃反應10 min，加入1 μl探針標記終止液，混勻，終止標記反應，再加入89 μl TE，混勻，存于-20℃冰箱備用。核蛋白樣本提取與蛋白定量。生物素標記DNA3’端并去吹TdT。Super-Shift反應，配制6.5%聚丙烯酰胺凝膠，配制好各反應體系，凝膠阻滯實驗（electrophoretic mobility shift assays, EMSA）室溫結合反應20 min，電泳上樣。電轉膜，操作方法同常規Western blot轉膜操作。紫外交聯，將核酸交聯于PVDF膜上。化學發光法檢測生物素標記的探針。

1.2.6 熒光素酶報告基因檢測 合成SNGH15的3’非編碼區，退火后插入熒光素酶基因下游的pCheck2報告熒光素酶載體的Xho1和NotⅠ位點。為了引入突變，將與3’UTR中HIF-1a的結合位點互補的序列(位點 1：5’-UGUUCUAGCUUCUCCC-3’，位點 2：5’-UU CCCCAACCUUCCU-3’，位點3：5’-UUCAUAGCCU UCUCCU-3’)替 換 為 位 點 1：5’-UGUUUCUAG UUACACCC-3’，位 點 2：5’-UUCCU-3’。經核苷酸測序證實構建成功。將SNGH15的陰性對照空載質粒或HIF-1a模擬質粒共轉染細胞。熒光素酶檢測采用雙熒光素酶報告分析系統（PROMEGA）。

1.2.7 染色質免疫共沉淀（Chip） 在細胞生長狀態下，加入交聯劑，對蛋白-染色質復合物進行交聯固定，裂解細胞，釋放蛋白-染色質復合物，通過超聲或酶解打斷長染色質片段，用抗體進行免疫沉淀，富集特異蛋白-DNA復合物，洗脫特異蛋白-DNA復合物，解交聯并消化蛋白，進行核酸純化，純化后的核酸進行PCR分析。

1.3 統計方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，計量資料符合正態分布，以（±s）表示，比較采用t檢驗；兩變量之間相關性采用Spearman相關性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SNGH15和HIF-1α的表達情況

與假手術組和正常對照組比較，模型組大鼠外周血與腦組織中SNHG15的表達水平明顯升高，且隨著時間的推移表達水平在不斷升高，12 h達到最高峰，隨后迅速下降，24 h時表達仍高于假手術組和正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.001）；正常對照組與假手術組之間SNGH15的表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。與假手術組和正常對照組比較，模型組大鼠 2、4、12、24 h的HIF-1α表達水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.001）；而假手術組和正常對照組之間HIF-1α表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表1 SNHG15的表達情況(±s)

表1 SNHG15的表達情況(±s)

組別模型組2 h (n=6)4 h (n=6)12 h (n=6)24 h (n=6)假手術組(n=3)正常對照組(n=3)F值P值表達情況138.33±1.818 152.30±1.417 168.58±1.654 122.03±1.243 53.20±2.331 53.96±1.059 3 729.676＜0.001

表2 HIF-1α的表達情況

2.2 大鼠腦梗死灶的呈色情況

TTC染色檢測結果可見，正常對照組和假手術組大鼠腦組織呈磚紅色，且未發現梗死灶的存在。模型組大鼠腦組織呈蒼白色，并且與周圍正常組織之間邊界清晰，具有明顯的梗死區域。見圖1。

圖1 TTC染色檢測大鼠腦梗死灶的呈色情況

2.3 SNHG15調控細胞增殖凋亡的信號通路

熒光素酶報告基因檢測：將過表達的HIF-1α質粒和空載質粒分別同SNHG15啟動子質粒一起轉染細胞，檢測報告基因轉錄活性，發現模型組啟動子的活性超過正常對照組的2倍，SNHG15啟動子區域具有轉錄因子HIF-1α的結合位點。見圖2。

圖2 熒光素酶報告基因檢測SNHG15啟動子與轉錄因子HIF-1α結合位點情況

EMSA及染色質免疫共沉淀（Chip）檢測：Thermo Scientific Plerce瓊脂糖Chip試劑盒顯示，NeuroD、C/ebp和RNA聚合酶Ⅱ與近端SNHG15的啟動子結合。穩定的過表達克隆細胞因子在0.2%炭葡聚糖處理的培養基中培養3 h，然后用100 ng/mL的HIF-1α處理細胞15 min，使用適當的抗體和Pierce Chip Kit對3個靶點進行染色質免疫沉淀，發現HIF-1α處理后與SHNG15的啟動子結合增加。見圖3。

圖3 EMSA及染色質免疫共沉淀（Chip）檢測SNHG15啟動子與轉錄因子HIF-1α結合情況

3 討論

小核仁RNA宿主基因15（SNHG15）是一種產生短半壽命lncRNA的snoRNA宿主基因[5]，在腫瘤細胞中上調并參與多種癌癥的發生發展，涉及到腫瘤細胞的侵襲、轉移等生物學過程[6]，在細胞的增殖凋亡調控中發揮著重要的作用。

本研究中，在低氧條件下SNHG15的含量升高，并且與缺氧的程度有著密切關系，與正常對照組比較，模型組大鼠外周血中SNHG15的表達水平在2、4、12、24 h分別為（138.33±1.818）、（152.30±1.417）、（168.58±1.654）、（122.03±1.243），4個時間點上都顯著增高，其表達從2 h開始發生，隨著時間的推移不斷升高，12 h達到峰值，隨后迅速下降，24 h時SNHG15的表達水平仍然高于正常對照組大鼠（P＜0.05）；而假手術組大鼠（53.20±2.331）與對照組大鼠（53.96±1.059）之間SNHG15的表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；而模型組大鼠SNHG15的表達水平在上述十個時間點也均高于假手術組大鼠（P＜0.05）。這與冀方超等[7]的研究結果一致，其研究中，SNHG15在急性腦梗死患者的外周血中異常高表達，表達量為（5.94±1.05），尤其是重癥患者最高，SNHG15異常表達的表達量（6.76±0.61）與NIHSS評分呈正相關（r=0.730，P＜0.05），與神經功能缺損程度以及多項病理參數有著密切的關系。同時，相關研究顯示，低氧培養時可促進SNHG15表達（5.877 5±0.365 97）上調（P＜0.05）[8]，這與本文研究結果基本一致，這說明SNHG15的含量與腦細胞缺氧程度之間關系密切。

HIF-1α作為HIF-1的調節亞基，其蛋白轉錄活性和穩定性都是受到細胞內氧的含量濃度調節[9]，HIF-1α的N端的bHLH域，與下游PAS域共同構成HIF-1α的氧張力感受區[10]，JAK2/STAT3/HIF-1α信號通路的激活或抑制對腦缺血再灌注的影響是復雜的，并不是單一的保護或者損害作用[11]。鄧文騫等[12]在對大鼠缺血再灌注腦梗死的實驗中發現，大腦局灶性缺血2 h再灌注后，大鼠大腦HIF-1α mRNA的水平和蛋白水平均比對照組高，缺血缺氧激活腦神經細胞HIF-1α基因的表達。本研究中：與正常對照組比較，模型組大鼠2、4、12 h外周血中HIF-1α的表達水平都顯著增高（133.10±8.387）、（149.72±1.489）、（168.58±2.363），到 24 h時 HIF-1α的表達水平（84.12±4.574）雖然沒有達到顯著水平，但是仍然高于正常對照組大鼠（53.97±2.052）（P＜0.05）；而假手術組大鼠與正常對照組大鼠之間HIF-1α的表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。這與顧霞等[13]研究結果：發現不同時間點，觀察組HIF-1α濃度均顯著高于對照組，分別以1、5 d后為例，1 d后大面積梗死組（3 287.6±1 472.1）、小面積梗死組（1 645.7±472.4），5 d后大面積梗死組（1 514.7±329.8），小面積梗死組（920.9±271.4），血清HIF-1a濃度與腦梗死面積存在顯著正相關關系（r=0.754，P＜0.05），HIF-1α參與了急性腦梗死的發生、發展過程的研究結果一致。表明在低氧相關疾病及高原病發生過程中，低氧誘導因子1α和相關信號通路中的關鍵因子的表達水平會發生不同程度變化[14]。表明在缺血缺氧脅迫條件下能夠刺激HIF-1α的表達，調控其下游靶基因的表達，而發揮腦保護作用。急性腦梗死患者血清中低氧誘導因子-1α的表達呈動態變化規律，在腦梗死的發生發展中發揮著重要的作用[15]；Notch信號通路在缺血再灌注損傷中被激活，其機制可能與HIF-1α有關[16]，而且高原適應具有遺傳學基礎，尤其與HIF通路及低氧反應基因密切相關[17]。因此，HIF-1α和SNGH15可作為腦梗死診斷標記分子，能夠對腦細胞增殖與凋亡進行調控，并且參與腦梗死的發生發展，LncRNA常常通過競爭性的結合并抑制microRNA而影響其下游基因的表達發揮作用。

綜上所述，本研究利用體內動物模型，鑒定SNHG15的啟動子區域，發現具有轉錄因子HIF-1α的結合位點，從而明確HIF-1α和SNHG15在腦梗死中的作用及其機制。有望為臨床治療腦梗死患者提供新的靶點，具有重要的科學意義和應用價值。