基于TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫探討VCAN基因及其甲基化在胃癌預后判斷中的價值*

張 謙，梁 魚，安彩艷

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學新藥安全評價研究中心/內(nèi)蒙古自治區(qū)新藥篩選工程研究中心/內(nèi)蒙古醫(yī)科大學藥學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學內(nèi)蒙古臨床醫(yī)學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，預后相對較差，嚴重危害人類健康[1-5]。根治性胃切除術仍然是治療胃癌的主要方法，但早期胃癌的診斷率不到10%，多數(shù)胃癌患者被發(fā)現(xiàn)時已處于晚期或轉(zhuǎn)移性階段[6-10]。50%～70%的晚期胃癌患者會經(jīng)歷術后復發(fā)，5年生存率低[11-13]。盡管許多致癌基因和抑癌基因被證實對胃癌的發(fā)生和發(fā)展有重要作用，一些分子靶向藥物已被應用于胃癌治療，但是目前仍較缺乏適合胃癌靶向治療的藥物[14-15]。因此，迫切需要探討胃癌發(fā)病的分子機制并尋找可靠的生物標志物作為胃癌早期診斷的基礎。

多功能蛋白聚糖基因(VCAN基因)位于染色體5q12-14，編碼產(chǎn)生4種蛋白聚糖亞型，體內(nèi)外研究表明，VCAN基因可以調(diào)節(jié)細胞的多種生理過程，例如細胞的黏附、增殖、遷移和腫瘤基質(zhì)血管生成等[16-20]。VCAN基因在很多腫瘤組織中異常表達都提示與腫瘤的不良預后有關。VCAN基因在胃癌中的表達及作用已有報道[16]，然而，VCAN基因在胃癌中的臨床意義和預后價值仍不清楚。本研究通過生物信息學方法分析癌癥基因組圖譜(TCGA)和基因表達(GEO)數(shù)據(jù)庫，研究VCAN基因及其甲基化在胃癌中的作用及對預后的影響，為下一步研究VCAN基因在胃癌發(fā)生發(fā)展、診斷、預后中的作用機制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 405例下載于TCGA數(shù)據(jù)庫的胃癌及癌旁正常組織數(shù)據(jù)用于分析VCAN基因在胃癌組織和正常胃組織中mRNA的表達差異，433例下載于GEO(GSE84437)數(shù)據(jù)庫的胃癌表達譜芯片數(shù)據(jù)集用于驗證VCAN基因在胃癌患者中的總體預后意義。

1.2方法

1.2.1TCGA數(shù)據(jù)下載和整理 使用UCSC-XENA工具(https://xena.ucsc.edu/)下載TCGA數(shù)據(jù)，包括基因表達數(shù)據(jù)(HTSeq-FPKM)、甲基化數(shù)據(jù)(Illumina Human Methylation 450)、生存數(shù)據(jù)、臨床指標、腫瘤無進展生存率(PFS)數(shù)據(jù)。根據(jù)基因表達數(shù)據(jù)(HTSeq-FPKM)提取單基因表達量；繪制VCAN基因高、低表達組生存曲線；繪制受試者工作特征(ROC)曲線判讀VCAN基因預測患者1、3、5年生存率的準確性；繪制VCAN基因高、低表達組PFS曲線；對VCAN基因進行獨立預后分析，以確定該基因是否可以獨立于其他臨床項目作為預后因子。

1.2.2基因表達和甲基化的相關性分析 根據(jù)下載的甲基化數(shù)據(jù)(Illumina Human Methylation 450)獲得甲基化舉證，繪制該基因啟動子區(qū)域甲基化箱線圖；進行甲基化相關性分析、甲基化生存分析、甲基化PFS分析，根據(jù)年齡、腫瘤分級、性別、腫瘤分期4個因素進行分組，統(tǒng)計各因素與VCAN基因表達和VCAN基因甲基化的相關性。

1.2.3Meta分析 通過PubMed GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)和TCGA數(shù)據(jù)庫下載有關VCAN基因和胃癌相關性的數(shù)據(jù)。利用Meta分析評估VCAN基因在胃癌患者中的總體預后意義。計算合并的風險比(HR)和95%CI以評估VCAN基因表達與胃癌患者預后的相關性。通過Q檢驗(I2統(tǒng)計)評估兩個數(shù)據(jù)集之間的異質(zhì)性。如果沒有明顯的異質(zhì)性(I2<50%)，則選擇固定效果模型進行組合。否則，將應用隨機效應模型。

1.2.4TIMER數(shù)據(jù)庫分析 通過TIMER數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)評估VCAN基因表達與5種免疫細胞或免疫分子(CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD2分子、CD3D分子、CD3E分子)的相關性。

1.2.5GO和KEGG富集分析 將胃癌患者數(shù)據(jù)集分為高VCAN基因表達組和低VCAN基因表達組。選擇兩組之間差異表達的基因。| logFC |≥1且P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。選擇GO和KEGG富集分析探討VCAN基因在胃癌中的功能和主要信號通路。

1.3統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。根據(jù)數(shù)據(jù)庫中VCAN基因mRNA的表達中位數(shù)建立VCAN基因低、高表達組。同樣，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫胃癌數(shù)據(jù)集中VCAN基因DNA甲基化的中位數(shù)，建立了VCAN基因的低甲基化組和高甲基化組。通過χ2檢驗或Fisher確切概率法分析VCAN基因表達或其DNA甲基化與一系列分類變量之間的關系。采用單因素和多因素Cox回歸模型來探討VCAN基因表達是否為胃癌患者的獨立預后指標。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫評估VCAN基因表達的臨床診斷和預后價值 通過TCGA數(shù)據(jù)庫VCAN基因RNA測序數(shù)據(jù)(正常胃組織32例、胃癌組織373例)，發(fā)現(xiàn)VCAN基因mRNA在正常胃組織中的表達較低，而在胃癌組織中高度表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1A。繪制VCAN基因高、低表達組總生存曲線，兩組總生存率(OS)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1B。ROC曲線說明，利用VCAN基因預測患者1、3、5年生存率準確性分別為0.595、0.625、0.764(圖1C)。繪制VCAN基因高、低表達組PFS曲線，兩組PFS差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1D。對年齡、腫瘤分級、性別、腫瘤分期、VCAN基因進行單因素分析，根據(jù)P<0.05和HR>1來篩選預后相關因子，分別為年齡、腫瘤分期和VCAN基因，然后再對年齡、腫瘤分期和VCAN基因進行多因素分析，發(fā)現(xiàn)VCAN基因P<0.05，說明VCAN基因可以獨立于其他臨床特征作為胃癌的預后因子(圖1E、F)。

注：A為VCAN基因 mRNA在胃癌組織、正常胃組織中的表達情況；B為VCAN基因不同表達情況患者的OS；C為以VCAN基因表達水平預測1、3、5年生存率；D為VCAN基因不同表達情況患者的PFS；E為單因素分析結果；F為多因素分析結果。

2.2VCAN基因中11個DNA啟動子CpG位點的分布及相關甲基化分析 VCAN基因中11個DNA啟動子CpG位點的分布如圖2所示。除cg04525496、cg15114672、cg16000227 CpG位點以外，cg00567749(r=-0.13，P<0.05)、cg02371408(r=-0.15，P<0.05)、cg02551029(r=-0.15，P<0.05)、cg05176349(r=-0.13，P<0.05)、cg0889138(r=0.23，P<0.05)、cg17771652(r=-0.18，P<0.05)、cg19540689(r=-0.13，P<0.05)、cg21810188(r=-0.14，P<0.05)CpG位點甲基化均與VCAN基因表達具有相關性。除cg02551029、cg04525496、cg08891382、cg15114672、cg16000227、cg17771652 CpG位點外，cg00567749、cg02371408、cg05176349、cg19540689、cg21810188 CpG位點甲基化高、低表達組間OS比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。除cg00567749、cg04525496、cg15114672、cg16000227、cg17771652 CpG位點外，cg02371408、cg02551029、cg05176349、cg08891382、cg19540689、cg21810188 CpG位點甲基化高、低表達組間PFS比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 VCAN基因中11個DNA啟動子CpG位點的分布箱式圖

2.3VCAN基因表達及其甲基化與臨床指標的相關性分析 根據(jù)年齡、腫瘤分級、性別、腫瘤分期4個因素進行分組，統(tǒng)計各因素與VCAN基因表達和VCAN基因甲基化的相關性。若P<0.05，說明該因素與VCAN基因表達和VCAN基因甲基化具有相關性，若P>0.05，說明該因素與VCAN基因表達及VCAN基因甲基化不具有相關性。如圖3所示，G2/G3腫瘤分級和Ⅰ/Ⅱ、Ⅰ/Ⅲ腫瘤分期與VCAN基因表達具有相關性(P<0.05)；年齡、腫瘤分級、性別、腫瘤分期與VCAN基因甲基化不具有相關性(P>0.05)。

注：A為VCAN基因表達與年齡的關系；B為VCAN基因表達與性別的關系；C為VCAN基因表達與腫瘤分級的關系；D為VCAN基因表達與腫瘤分期的關系；E為VCAN基因甲基化與年齡的關系；F為VCAN基因甲基化與性別的關系；G為VCAN基因甲基化與腫瘤分級的關系；H為VCAN基因甲基化與腫瘤分期的關系。

2.4VCAN基因表達的Meta分析 利用Meta分析從TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中選取806例胃癌組織，評估VCAN基因在胃癌患者總體預后中的意義。計算合并的HR和95%CI以評估VCAN基因表達與胃癌患者預后的關系。合并的HR為1.22(>1)，說明該基因為胃癌發(fā)生的高風險基因，并與胃癌預后具有良好的相關性(圖4)。

圖4 VCAN基因與患者預后的Meta分析

2.5VCAN基因與免疫細胞的關系 在散點圖上，VCAN基因表達與CD4+T細胞的免疫浸潤呈正相關(r=0.152，P<0.05)，與CD8+T細胞的免疫浸潤也呈正相關(r=0.453，P<0.05)。VCAN基因表達與免疫分子CD2的免疫浸潤呈正相關(r=0.257，P<0.05)，與免疫分子CD3D的免疫浸潤呈正相關(r=0.167，P<0.05)，與免疫分子CD3E的免疫浸潤也呈正相關(r=0.193，P<0.05)。

2.6GO富集結果分析 運用R軟件將作用靶點進行GO富集分析(圖5)，共得到GO條目653個，其中生物學過程(BP)549個，分子功能(MF)62個，細胞成分(CC)42個。以P<0.05為篩選標準進行篩選，將P值由小到大分別選取BP、MF和CC中前10條通路進行部分展示。

圖5 VCAN 基因GO富集分析

2.7KEGG 富集結果分析 運用R語言進行KEGG富集分析，運行后得到160條通路，以P<0.05為篩選標準進行篩選，將P值由小到大選取前30條通路進行部分展示(圖6)。

圖6 VCAN基因KEGG富集分析

3 討 論

在本研究中，通過TCGA數(shù)據(jù)庫，筆者根據(jù)胃癌組織及正常胃組織中VCAN基因mRNA表達量及VCAN基因甲基化探討了VCAN基因在胃癌的臨床診斷和預后中的應用價值。通過一系列生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)了胃癌組織中的VCAN基因mRNA高表達，且VCAN基因mRNA表達和VCAN基因甲基化均與胃癌OS密切相關。VCAN基因表達和VCAN基因甲基化均與一系列重要特征有關，包括腫瘤的組織學類型和分子類型[21-22]。Cox回歸模型確定了VCAN基因高表達對于胃癌患者預示著不良的預后。此外，本研究還驗證了GEO數(shù)據(jù)庫中VCAN基因表達的預測作用，結果都證實了VCAN基因表達在胃癌患者預后判斷中的價值。通過Meta分析選擇來自2個不同數(shù)據(jù)庫的806例胃癌患者，進一步證明了VCAN基因表達是胃癌患者生存的獨立預后因素。本研究利用TCGA和GEO數(shù)據(jù)集，確認了VCAN基因表達與胃癌腫瘤分級、分期等臨床病理特征密切相關，即VCAN基因高表達的胃癌患者臨床惡性程度越高，預后較差，提示VCAN基因有望成為胃癌治療和預后評估的新靶點。

越來越多的研究[6,9]表明：異常的DNA甲基化與胃癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關。本研究首先鑒定了VCAN基因DNA啟動子區(qū)域中的特定CpG位點，該位點發(fā)生甲基化會明顯影響VCAN基因的表達。11個CpG位點中有8個CpG位點的甲基化與VCAN基因表達緊密相關。筆者還研究了VCAN基因DNA甲基化和11個選定的CpG位點對預后的意義，發(fā)現(xiàn)VCAN基因高甲基化與胃癌患者的OS和PFS相關。以上結果提示，VCAN基因受VCAN基因甲基化的負調(diào)控，而VCAN基因甲基化的狀態(tài)可能是體現(xiàn)OS和PFS良好的效應指標。有研究表明，腫瘤浸潤免疫細胞已經(jīng)成為腫瘤生長的關鍵調(diào)節(jié)因子，并與患者生存率相關[3]。分析表明，VCAN基因mRNA表達和一系列免疫標記，如CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD2、CD3D、CD3E水平顯著相關。VCAN基因表達與一些免疫抑制膜蛋白，包括T細胞免疫球蛋白和ITIM結構域蛋白(TIGIT)、細胞毒性T細胞相關蛋白4(CTLA4)、吲哚胺2,3-雙加氧酶-1(IDO1)、T細胞共刺激器(ICOS)密切相關[4]。這些結果表明，VCAN基因主要通過調(diào)節(jié)胃癌細胞中CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD2、CD3D、CD3E等免疫細胞和分子來參與腫瘤免疫過程[23-25]。VCAN基因高表達對胃癌患者預后的影響很可能與免疫浸潤有關。

值得注意的是，本研究也有一定的局限性，例如：只有TCGA數(shù)據(jù)庫包含PFS信息，以及VCAN基因表達和PFS的關系無法在GEO數(shù)據(jù)庫中進行驗證。此外，本研究通過GO和KEGG富集分析，初步探討了VCAN基因在胃癌中的作用，但是將VCAN基因表達和VCAN基因甲基化與胃癌進展聯(lián)系起來的詳細機制還需要進一步生物醫(yī)學實驗來進行驗證。

綜上所述，本研究通過生物信息學方法對胃癌大樣本測序數(shù)據(jù)進行分析，揭示了VCAN基因在胃癌中可能發(fā)揮的在治療和預測預后方面的價值，為接下來進一步探討VCAN基因的生物學功能及其作用機制提供了線索和依據(jù)。