基于網絡藥理學探討侯氏黑散治療缺血性腦卒中的作用機制

烏凱迪，蔣希成，宋 瑩，王 振

缺血性腦卒中是由于腦動脈長時間狹窄或堵塞造成該動脈供血區域出現腦細胞壞死或細胞死亡的疾病，具有較高的致殘率、致死率，為中老年多發病[1-2]。臨床常見的腦功能障礙臨床表現為一側肢體麻木、偏癱、視物模糊、口舌歪斜、口角流涎、語言障礙、理解障礙等，嚴重時甚至導致昏迷。誘發缺血性腦卒中的原因較多，相關研究顯示，高血壓、吸煙、低高密度脂蛋白膽固醇、心臟病和飲酒等為缺血性腦卒中危險因素[3]。侯氏黑散首見于《金匱要略·中風歷節》記載，由菊花、白術、牡蠣、桔梗、防風、細辛、茯苓、人參、礬石、黃芩、當歸、干姜、川芎、桂枝14味中藥組成，現代醫家多用于治療短暫性腦缺血發作、眩暈、中風、眼目病等[4]。侯氏黑散具有降低血壓、調節血脂的作用，為治療缺血性腦卒中奠定了基礎[5]。本研究基于網絡藥理學，運用計算機模擬、數據分析、多種數據庫檢索等方法，通過多層次網絡闡明藥物的物質基礎及作用機制[6]，為藥物的現代化研究提供了新思路。本研究通過檢索相關數據庫，構建“藥物成分-作用靶點”網絡，探討侯氏黑散治療缺血性腦卒中的多成分、多靶點和多通路作用特點，為闡明其治療缺血性腦卒中機制提供了科學依據，為進一步研究奠定了基礎。

1 資料與方法

1.1 侯氏黑散活性成分的挖掘與篩選 檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)侯氏黑散中的菊花、白術、細辛、茯苓、牡蠣、桔梗、防風、人參、白礬、黃芩、當歸、干姜、川芎、桂枝14味中藥，利用TCMSP得到的數據參數中口服生物利用度(OB)和類藥性(DL)對藥物成分進行篩選，篩選出符合OB≥30%、DL≥0.18兩個條件的藥物活性成分。因牡蠣作為動物類藥材的特殊性，故本研究未將其納入分析。

1.2 侯氏黑散活性成分作用靶點的收集 利用TCMSP收集侯氏黑散所有藥物活性成分的作用靶點，篩選作用于“人”的靶點，再利用UniProt數據庫找到作用靶點對應的Gene Symbol[7]。

1.3 缺血性腦卒中疾病靶點的挖掘 在GeneCards數據庫中輸入關鍵詞“ischemic stroke”，得到缺血性腦卒中的相關靶基因。

1.4 侯氏黑散治療缺血性腦卒中的核心靶點篩選 運用Venny 2.1.0在線工具進行侯氏黑散活性成分靶點和缺血性腦卒中疾病靶點的映射并繪制韋恩圖，得到侯氏黑散治療缺血性腦卒中的相關靶點[8]。

1.5 活性成分-作用靶點網絡的構建及拓撲分析 采用Cytoscape 3.6.1軟件構建侯氏黑散藥物活性成分-作用靶點網絡，該拓撲網絡中活性成分、作用靶點用節點表示，邊代表活性成分與靶點的相互作用關系。利用Cytoscape 3.6.1軟件工具中的“Analyzer”功能，分析網絡拓撲結構，計算相關拓撲參數。

1.6 構建并分析蛋白-蛋白互作(PPI)網絡 將篩選得到的治療缺血性腦卒中的靶點蛋白以Gene Symbol上傳至STRING 11.0數據庫，構建PPI并進行數據分析[9]。

1.7 侯氏黑散治療缺血性腦卒中的靶點通路分析 將篩選的交集靶點信息利用DAVID 6.7進行基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，根據信號通路富集分析結果探討侯氏黑散治療缺血性腦卒中的潛在作用機制[10]。

2 結 果

2.1 侯氏黑散活性成分和作用靶點的篩選 通過TCMSP分析平臺檢索到侯氏黑散共1 930個化合物，篩選條件為OB≥30%、DL≥0.18，得到主要活性成分共155個，其中菊花20個，白術7個，細辛8個，茯苓15個，桔梗7個，防風18個，人參22個，黃芩36個，當歸2個，干姜5個，川芎7個，桂枝7個，白礬1個。按照OB值進行排列，居前20位的活性成分見表1。采用TCMSP平臺對155個藥物活性成分進行靶點檢索，共收集到靶點1 246個，經過篩選去重后得到164個。

表1 藥物活性成分(居前20位)

2.2 侯氏黑散藥物活性成分-作用靶點網絡的構建及拓撲分析 利用Cytoscape 3.6.1軟件對侯氏黑散中藥物活性成分-作用靶點關系數據進行網絡構建和分析，得到包含273個點和1 246條邊的網絡，詳見圖1。以Degree值作為拓撲分析的主要參數依據，居前5位的靶點為前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)、槲皮苷(quercetin)、前列腺素內過氧化物合酶1(PTGS1)、熱休克蛋白90(HSP90)和山奈酚(kaempferol)。詳見表2。

圖1 活性成分-作用靶點網絡圖

表2 藥物活性成分靶點(Degree值居前5位)

2.3 侯氏黑散治療缺血性腦卒中的潛在作用靶點 通過GeneCards檢索到缺血性腦卒中靶點3 173個，利用Venny 2.1.0在線工具將缺血性腦卒中靶點與164個侯氏黑散作用靶點進行映射取交集靶點121個，詳見圖2。主要包括白細胞介素6(IL-6)、血清對氧磷酶1(PON1)、PTGS2、白細胞介素2(IL-2)、趨化因子(CCL2)等。詳見表3。

圖2 藥物靶點-疾病靶點韋恩圖

表3 藥物作用靶點

2.4 侯氏黑散治療缺血性腦卒中PPI網絡的構建 利用STRING數據庫構建侯氏黑散治療缺血性腦卒中相關靶點的PPI網絡，包含121個節點，其中有兩個無相互作用的蛋白質節點，1 308條邊，平均節點Degree值為21.6，PPI富集，P<1×10-16。詳見圖3。

圖3 交集靶點PPI網絡

2.5 GO功能富集分析 通過DAVID 6.7數據庫對侯氏黑散治療缺血性腦卒中相關候選靶基因進行GO功能富集分析，從分子功能(MF)、生物過程(BP)和細胞成分(CC)分別得到P<0.05的條目包括70個、494個、55個。篩選居前10位的GO條目繪制柱狀圖(見圖4～圖6)。MF相關條目主要涉及胺受體活性(amine receptor activity)、配體依賴性核受體活性(ligand-dependent nuclear receptor activity)、胺結合(amine binding)等；BP相關條目主要涉及細胞增殖調控(regulation of cell proliferation)、對有機物的反應(response to organic substance)、系統過程的調節(regulation of system process)等；CC相關條目主要涉及細胞分子(cell fraction)、不溶性組分(insoluble fraction)、膜組分(membrane fraction)等。

圖4 MF富集分析(居前10位)(橫坐標藍色表示富集該條GO條目的基因個數；橘色為P值)

圖5 BP富集分析(居前10位)(橫坐標藍色表示富集該條GO條目的基因個數；橘色為P值)

圖6 CC富集分析(居前10位)(橫坐標藍色表示富集該條GO條目的基因個數；橘色為P值)

2.6 KEGG通路富集分析 通過DAVID 6.7數據庫對侯氏黑散治療缺血性腦卒中靶點進行KEGG通路富集分析，以P<0.05進行篩選，得到47條信號通路，將篩選數據繪制成氣泡圖，居前20位KEGG通路分別為癌癥信號通路(pathways in cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、鈣信號通路(calcium signaling pathway)、黃體酮介導的卵母細胞成熟(progesterone-mediate oocyte maturation)、前列腺癌(prostate cancer)、 NOD樣受體信號通路(NOD-like receptor signaling pathway)、藥物代謝(drug metabolism)、胰島素信號通路(insulin signaling pathway)、 胰腺癌(pancreatic cancer)、非小細胞性肺癌(non-small cell lung cancer)。詳見圖7。

圖7 KEGG通路富集分析(居前20位)

3 討 論

本研究以網絡藥理學為切入點，借助TCMSP、GeneCards、DAVID等數據庫檢索侯氏黑散的活性成分、作用靶點及缺血性腦卒中的疾病靶點等，通過Cytoscape等軟件構建活性成分-作用靶點網絡、PPI網絡等，宏觀系統分析侯氏黑散治療缺血性腦卒中的作用機制。

通過對活性成分-作用靶點的分析，發現Degree值居前5位的靶點為PTGS2、槲皮苷、PTGS1、HSP90和山奈酚。有研究顯示，PTGS2表達可抑制核轉錄因子-κB通路，進一步抑制細胞凋亡，促進細胞增殖、遷移，為缺血性腦卒中發展過程中的受損細胞提供保護和治療作用[11]。PTGS1可抑制血小板聚集，降低血栓形成風險，從而可能為治療缺血性腦卒中提供理論[12]。PTGS參與血壓調節及凝血平衡等多種生理病理過程[13]。楊冉等[14]研究顯示，槲皮素能上調相關蛋白表達，對腦缺血再灌注大鼠的血腦屏障具有保護作用，同時減少炎癥相關因子表達，如TNF-α、IL-8等[15]。槲皮素可抑制炎性小體NLRP3，改善高脂血癥[16]。Zhang等[17]采用槲皮素治療腦缺血模型大鼠，結果表明槲皮素治療可明顯改善神經功能恢復，增加抗炎細胞因子，減少促炎因子，抑制細胞凋亡并提高受損區域修復率。Si等[18]實驗表明，槲皮素的抗炎作用主要通過抑制核轉錄因子-κB和MAPK信號通路而發揮作用。HSP90主要參與腫瘤反應、炎癥反應和細胞增殖過程。有研究表明，抑制HSP90可間接減少部分促炎因子表達，從而減輕腦梗死區域炎癥反應[19]。相關研究顯示，山奈酚可能影響細胞增殖與凋亡，抑制細胞自噬，誘導NLRP3合成；也可抑制神經炎癥，從而改善腦缺血再灌注引起的細胞損傷和神經功能受損[20-21]。

通過GeneCards檢索出缺血性腦卒中疾病靶點3 052個，與侯氏黑散活性成分對應的作用靶點共121個交集。IL-6可能參與缺血性腦卒中早期炎癥反應，表明通過抑制IL-6表達，減少疾病早期炎癥反應，從而保護腦細胞，降低疾病發生風險[22]。有研究表明，TNF相關因子引起的神經細胞凋亡，加重缺血性腦卒中病情，增大腦梗死面積[23]。高元杰等[24]通過檢測腦梗死合并肺部感染病人相關指標，結果顯示，感染組血清TNF相關因子高于非感染組，結果顯示TNF相關因子明顯改變，可能引起腦梗死等相關疾病。IL-1β增多可破壞磷脂雙分子層和血腦屏障，增加血管通透性；IL-1β可激活各種炎癥介質釋放，從而加重腦損傷程度[25]。提示侯氏黑散治療缺血性腦卒中可能通過這些靶點發揮作用，為今后實驗提供研究方向。

通過DAVID數據庫對交集靶點進行GO功能富集分析，結果表明交集靶點的生物過程富集于細胞增殖調控，對有機物的反應和系統過程調節。有研究顯示，細胞的增殖調控有利于恢復受損神經細胞局部血管的重建及受損血管的修復，對恢復組織功能具有重要的臨床意義[26]。體內血壓、血脂、血糖等指標變化，可能影響缺血性腦卒中的發生發展，因此，調控機體的相關指標可能成為預防和治療缺血性腦卒中的重點。

通過對交集靶點的KEGG通路富集分析，篩選出P<0.05的信號通路47條，本研究列出了前20條通路，包括NOD樣受體信號通路、胰島素信號通路、鈣信號通路等，其中NOD樣受體信號通路參與較多疾病的生理過程，與炎癥反應和免疫調節密切相關。Li等[27]通過對照組和研究組對受體肝細胞進行處理，注入小鼠，KEGG信號通路分析結果顯示被激活的NOD樣受體信號通路在體內外均可引起炎癥反應。Uehara等[28]利用NOD相關配體刺激導致IL-6和IL-8釋放，結果顯示NOD積極參與牙齦組織的炎癥反應和先天性免疫應答。辛洪杰等[29]研究顯示，活化后NOD可激活下游信號通路，促進IL-6、IL-8、IL-10和部分趨化因子(CXCL2、CCL3、CCL4及CCL5)的釋放，發揮促炎作用。NOD樣受體信號通路在細胞缺血再灌注時可減少炎癥反應發生[30]。相關有機物通過胰島素信號通路調節體內胰島素水平，進而調節血糖指數，為治療高血糖引起的缺血性腦卒中提供可能[31]。鈣信號通路受損可能引起神經元膜脂質過氧化，使膜轉運系統受到氧化損害，導致神經元損傷[32]。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學方法分析結果表明侯氏黑散通過多成分、多靶點、多通路治療缺血性腦卒中，預測侯氏黑散居前5位主要活性成分是PTGS2、槲皮苷、山奈酚、PTGS1、HSP90，主要通過調節IL-6、PON1、IL-2、CCL2等靶點，調控NOD樣受體信號通路、胰島素信號通路等減少炎癥反應發生，提高免疫水平，修復受損神經，達到治療缺血性腦卒中的目的。從整體性、系統性角度分析侯氏黑散的藥效機制，為今后研究奠定了基礎。本研究僅從網絡藥理學角度分析具有局限性：本方有14味藥，藥味過多，應結合病人臨床情況進行具體辨證論治；進一步驗證上述成分、靶點及信號通路的作用機制。