circPRKCI靶向miR-217對缺氧/復氧誘導心肌細胞損傷的影響

劉 頒，姜丕橋，熊桂麗，焦 奇

急性心肌梗死等心血管疾病是威脅人類生命安全的主要疾病，再灌注治療可緩解心肌缺血缺氧，同時也可加重缺血再灌注損傷，從而降低治療效果，已知氧化應激、細胞凋亡等是導致心肌細胞損傷的主要原因，因此，如何減輕心肌細胞損傷成為治療缺血再灌注損傷的研究熱點[1]。環狀RNA(circRNA)可充當微小RNA(miRNA)的海綿分子，參與心肌細胞損傷過程，并可能作為治療的潛在靶標[2-4]。circPRKCI在脂多糖誘導的人腎小管上皮細胞中呈低表達，上調其表達可通過miR-545/ZEB2分子軸減輕細胞損傷[5]。但circPRKCI在心肌細胞損傷中的作用機制尚未明確。靶基因預測顯示miR-217與circPRKCI存在結合位點，抑制miR-217表達通過核轉錄因子-κB(NF-κB)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑可防止心肌缺血-再灌注損傷[6]。但circPRKCI是否通過靶向調控miR-217表達影響缺氧/復氧(H/R)誘導的心肌細胞損傷尚未明確。本研究采用H/R誘導的心肌細胞建立細胞損傷模型，探討circPRKCI/miR-217對H/R誘導的心肌細胞氧化應激和凋亡的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 大鼠心肌細胞H9c2購自上海弘順生物科技有限公司；DMEM培養基購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000、Trizol購自美國Invitrogen公司；反轉錄與熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑購自北京天根生化科技有限公司；pcDNA、pcDNA-circPRKCI購自美國Invitrogen公司；miR-NC、miR-217 mimics、si-NC、si-circPRKCI、anti-miR-NC、anti-miR-217購自廣州銳博生物科技有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗購自美國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 心肌細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，取對數生長期心肌細胞(1×105個/mL)接種于96孔板(每孔100 μL)，將培養液更換為不含血清的DMEM培養液，細胞置入37 ℃，95%N2，體積分數5%CO2培養箱內缺氧處理3 h，之后將培養液更換為含10%胎牛血清的DMEM培養液，將其置入37 ℃、體積分數5%CO2培養箱內復氧處理4 h[7]，作為H/R組。將正常培養的心肌細胞作為對照組。pcDNA、pcDNA-circPRKCI、anti-miR-NC、anti-miR-217、pcDNA-circPRKCI與miR-NC、pcDNA-circPRKCI與miR-217 mimics分別轉染至心肌細胞后進行H/R處理，分別作為H/R+pcDNA組、H/R+pcDNA-circPRKCI組、H/R+anti-miR-NC組、H/R+anti-miR-217組、H/R+pcDNA-circPRKCI+miR-NC組、H/R+pcDNA-circPRKCI+miR-217組。

1.2.2 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測細胞circPRKCI、miR-217表達水平 采用Trizol法提取各組心肌細胞總RNA，應用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度后置于-80 ℃超低溫冰箱內保存。應用反轉錄試劑盒將總RNA合成cDNA，cDNA稀釋20倍后進行qRT-PCR，按照試劑盒說明書配置反應體系及設置反應條件，應用美國ABI StepOnePlus實時熒光定量PCR儀檢測circPRKCI、miR-217表達水平。

1.2.3 檢測MDA、SOD、GSH-Px含量 采用反復凍融法裂解各組心肌細胞，使用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，5，5′-二硫代(2-硝基苯甲酸)雙比色法測定GSH-Px活性，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 各組心肌細胞中加入預冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，棄上清液后收集細胞沉淀，加入500 μL結合緩沖液重懸細胞后，分別加入5 μL染色液(Annexin V-FITC)與5 μL碘化丙啶(PI)，充分混勻后室溫孵育10 min，應用FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測circPRKCI與miR-217的靶向關系 StarBase預測顯示circPRKCI與miR-217存在結合位點，分別構建野生型載體WT-circPRKCI與突變型載體MUT-circPRKCI，將其分別與miR-NC、miR-217 mimics共轉染至心肌細胞后繼續培養24 h并檢測熒光素酶活性。

1.2.6 免疫印跡法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達 各組心肌細胞加入400 μL放射免疫沉淀(RIPA)裂解液提取細胞總蛋白，采用2，2-聯喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)法檢測蛋白濃度后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉膜、封閉2 h后加入一抗稀釋液(1∶1 000)，4 ℃條件下孵育24 h后使用TBST洗滌，加入二抗稀釋液(1∶2 000)后置于室溫孵育1 h，使用TBST洗滌后加入電化學發光(ECL)液，暗室內曝光顯影，應用Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結 果

2.1 circPRKCI和miR-217在H/R誘導的心肌細胞損傷中的表達 與對照組比較，H/R組circPRKCI表達水平降低，miR-217表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.001)。詳見表1。

表1 circPRKCI和miR-217在H/R誘導的心肌細胞損傷中的表達(±s)

2.2 circPRKCI過表達對H/R誘導的心肌細胞損傷的影響 與對照組比較，H/R組MDA含量、細胞凋亡率增加(P<0.05)，SOD、GSH-Px、Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)；與H/R+pcDNA組比較，H/R+pcDNA-circPRKCI組MDA含量、細胞凋亡率降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性增加，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，Bax蛋白水平降低(P<0.05)。詳見圖1、表2。

表2 circPRKCI過表達對H/R誘導的心肌細胞損傷的影響(±s)

2.3 circPRKCI靶向調控miR-217的表達 StarBase預測提示circPRKCI與miR-217存在結合位點，詳見圖2。miR-217過表達可降低野生型載體WT-circPRKCI熒光素酶活性(P<0.001)，而對突變型載體MUT-circPRKCI的熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)，詳見表3。與pcDNA組比較，pcDNA-circPRKCI組miR-217表達水平降低(P<0.05)；與si-NC組比較，si-circPRKCI組miR-217表達水平升高(P<0.05)，詳見表4。

表3 雙熒光素酶實驗結果(±s)

表4 circPRKCI調控miR-217的表達(±s)

2.4 干擾miR-217表達對H/R誘導的心肌細胞損傷的影響 與H/R+anti-miR-NC組比較，H/R+anti-miR-217組MDA含量降低，SOD、GSH-Px活性升高，細胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白水平升高，Bax蛋白水平降低，差異有統計學意義(P<0.001)。詳見圖3、表5。

圖3 干擾miR-217表達對H/R誘導的心肌細胞凋亡的影響(A為凋亡相關蛋白表達電泳圖；B為細胞凋亡流式圖)

表5 干擾miR-217表達對H/R誘導的心肌細胞損傷的影響(±s)

2.5 上調miR-217表達逆轉了circPRKCI過表達對H/R誘導的心肌細胞損傷的作用 與H/R+pcDNA-circPRKCI+miR-NC組比較，H/R+pcDNA-circPRKCI+miR-217組MDA含量升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性降低，細胞凋亡率增加，Bcl-2蛋白水平降低，Bax蛋白水平升高，差異有統計學意義(P<0.001)。詳見圖4、表6。

圖4 上調miR-217表達逆轉了circPRKCI過表達對H/R誘導的心肌細胞凋亡的作用(A為凋亡相關蛋白表達電泳圖；B為細胞凋亡流式細胞圖)

表6 上調miR-217表達逆轉了circPRKCI過表達對H/R誘導的心肌細胞損傷的作用(±s)

3 討 論

急性心肌梗死病理過程復雜，而心肌缺血再灌注損傷是加重心肌細胞凋亡的重要原因之一，因而尋找心肌損傷調控靶點或作用機制對提高病人治療效果具有重要的意義。circHIPK3通過miR-29a/胰島素樣生長因子1(IGF-1)通路調節缺氧誘導的心肌細胞氧化損傷[8]。沉默circ-0010729通過上調miR-145-5p減輕心肌細胞損傷[9]。circRNA-101237通過靶向let-7a-5p/IGF2BP3介導心肌細胞H/R損傷[10]。但circPRKCI在心肌細胞損傷中的作用機制尚未明確。

circPRKCI在過氧化氫誘導的神經元細胞中表達水平降低，上調其表達通過miR-545/589-E2F7軸介導過氧化氫誘導的神經元細胞損傷[11]。本研究結果顯示，H/R誘導的心肌細胞circPRKCI表達水平降低，提示circPRKCI表達下調可能加重心肌細胞氧化損傷。本研究結果顯示，H/R誘導的心肌細胞MDA含量升高，SOD、GSH-Px活性降低，與相關研究報道結果[12-13]相似，提示成功建立心肌細胞氧化損傷模型。本研究通過體外細胞實驗證實，circPRKCI過表達可降低H/R誘導心肌細胞中MDA含量，增強SOD、GSH-Px活性，提示circPRKCI過表達可抑制氧化應激，從而減輕H/R誘導心肌細胞損傷。氧自由基生成量增加可激活線粒體凋亡途徑，其中Bcl-2表達水平降低，而Bax表達水平升高，通過激活Caspase-3從而誘導細胞凋亡[14-15]。本研究結果顯示，H/R誘導的心肌細胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白水平降低，Bax蛋白水平升高，circPRKCI過表達可降低H/R誘導的心肌細胞凋亡率，并可抑制Bax表達及促進Bcl-2表達，提示circPRKCI過表達可抑制氧化應激誘導的細胞凋亡，從而減輕心肌細胞氧化損傷。

本研究結果還證實circPRKCI可充當miR-217的海綿分子，并負向調控miR-217表達及活性。抑制miR-217表達可通過恢復張力蛋白同源物(PTEN)介導的自噬途徑減輕高糖誘導的足細胞損傷[16]。miR-217通過靶向磷酸酯酶與PTEN促進心臟肥大和功能障礙[17]。miR-217表達上調可促進高糖誘導的足細胞凋亡[18]。本研究結果顯示，H/R誘導的心肌細胞miR-217表達水平升高，抑制miR-217表達可明顯降低MDA含量，增強SOD、GSH-Px活性，并降低細胞凋亡率，提示抑制miR-217表達可增強細胞抗氧化能力及抑制細胞凋亡，從而減輕H/R誘導的心肌細胞凋亡。本研究結果顯示，circPRKCI過表達與miR-217過表達聯合處理可提高MDA含量，減低SOD、GSH-Px活性，并提高細胞凋亡率，提示miR-217過表達可逆轉circPRKCI過表達對H/R誘導的心肌細胞氧化應激及凋亡作用。

綜上所述，H/R誘導的心肌細胞中circPRKCI表達水平降低，而miR-217表達水平升高，circPRKCI過表達通過下調miR-217表達抑制氧化應激及其誘導細胞凋亡，從而減輕心肌細胞氧化損傷，circPRKCI/miR-217可能作為心肌缺血再灌注損傷的治療靶點，但具體作用機制需進一步分析。