鹽酸青藤堿對佐劑性關節炎大鼠NLRP3炎性小體的影響及分子機制的研究?

姚璐莎，羅常春，張 超

湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007

鹽酸青藤堿（sinomenine，SN）是從中藥青風藤中提取的生物堿單體［1］，具有鎮痛、抗炎、免疫抑制等藥理作用，治療風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）有確切療效和較好的安全性，逐漸成為治療風濕病的一線藥物［2］。已有研究表明，體外一定濃度的SN可通過抑制核轉錄因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的活性，從而降低大鼠巨噬細胞內腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白細胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）mRNA的表達［3］。本課題組前期研究發現，SN對佐劑性關節炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠關節肥大細胞的表達及其脫顆粒率、血清白細胞介素6（Interleukin-6，IL-6）水平具有明顯的抑制作用［4］。此外，其他動物模型和臨床研究［5-7］報道，SN可明顯抑制巨噬細胞炎性因子的分泌、T細胞和B細胞的增殖，促進細胞凋亡并下調基質金屬蛋白酶的表達。核苷酸結合寡聚化結構域受體（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小體是一種細胞質內的多蛋白聚合物，主要由NLRP3、半胱氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）、凋亡相關點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）組成，是天然免疫系統的重要組成部分［8］。NLRP3炎性小體參與Caspase-1的活化，促進炎性細胞因子IL-1β、白細胞介素18（interleukin-18，IL-18）、白細胞介素33（interleukin-33，IL-33）等促炎細胞因子的分泌，還可調節免疫應答和炎性反應［9］。因此，本研究擬探討SN對AA大鼠NLRP3炎性小體的影響及其分子機制，以期進一步闡明SN對RA的治療作用及相關機制，進而為RA的治療提供新的思路與靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選用7～11周齡SPF級雄性Wistar大鼠50只，體質量在130～160 g，實驗動物合格證號：SCXK2010-0016，由西南醫科大學實驗動物中心提供，飼養條件：屏障環境中。

1.2 試劑及藥品SN粉末（湖南正清制藥集團股份有限公司，批號：B21440-20）；雷公藤多苷片（黃石飛云制藥有限公司，批號：Z44023753，10 mg/片）；完全弗氏佐劑（美國Sigma公司，批號：F5881）；卡介苗（BCG）（北京生物制品研究所，批號：S10820017，500 mg/支）。IL-18、IL-1β和TNF-α酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司，批號：EH0302）；8-OHdG和MDA檢測試劑盒（上海康朗生物技術有限公司，批號：S0131）；實驗所用抗體［英國Abcam及美國Cell Signaling Technology（CST）公司，批號：S78465］。

1.3 造模及分組對40只Wistar大鼠進行造模。采用75%酒精消毒大鼠尾部，于尾部中內1/3交界處分6、7點皮內注射弗氏完全佐劑（將BCG與CFA臨用前充分搖勻，取適量BCG與CFA經雙注射器反復推吸乳化，配置成20 mg的BCG/mL的乳劑）；另設10只為正常對照組，于相應部位注射0.2 mL生理鹽水。造模14天后，有40只大鼠出現二次反應，關節炎指數大于4為造模成功，成功率80%。共獲得40只成功造模大鼠，將其隨機分為模型組，陽性對照組，青藤堿高、低劑量組，每組10只。

1.4 給藥方法正常對照組和模型組每天給予生理鹽水每天1 mL/100 g灌胃。陽性對照組以雷公藤多苷片碾碎后灌胃：給藥劑量為每天4 mg/kg，給藥濃度1 mg/mL。青藤堿高、低劑量組予以SN粉末和無菌注射用水混合灌胃：給藥劑量為每天20、10 mg/kg，給藥濃度1 mg/mL。給藥時間均為上午10點，給藥4周。

1.5 觀察指標

1.5.1 HE染色觀察大鼠踝關節組織病理改變 大鼠腹主動脈取血后，迅速用剪刀剪下大鼠右踝關節，置于10%甲醛固定液中固定24 h，一部分石蠟切片經二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水后采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光學顯微鏡下觀察踝關節的滑膜增生，炎性細胞浸潤以及軟骨骨質破壞及關節周圍組織水腫等病理學變化，并根據文獻［10］進行半定量評分。評分標準：0分：無紅腫；1分：個別足趾輕度紅腫；2分：大部分足趾關節及足跖紅腫；3分：踝關節以下足掌嚴重紅腫；4分：包括踝關節在內的全部足爪紅腫。

1.5.2 大鼠關節炎指數 造模后第14天起，每周觀察大鼠的關節炎指數（arthritic index，AI）值。AI值根據關節紅腫程度參照文獻方法進行評定［10-11］。AI=四肢關節評分之和。

1.5.3 ELISA檢測血清炎性因子水平 末次給藥后，大鼠禁食12 h后處死。用10%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，剖腹，分離腹主動脈取血2 mL，靜置30 min，血標本以離心半徑8 cm，2000 r/min離心10 min，吸取上清，分別采用ELISA和比色法檢測大鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-α、8-OHdG和MDA的表達水平，檢測步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.5.4 Western blot檢測滑膜組織中NF-κB/NLRP3信號通路蛋白表達 處死大鼠后，將其仰位固定，酒精消毒，沿膝關節正中縱行切開皮膚直至暴露出以膝關節為中心約3 cm×3 cm的區域，以齒鑷提起髕骨。沿髕骨上沿約0.3 cm×0.4 cm處向下切割直至股骨，再分別沿髕骨兩側向下分離至脛骨，打開膝關節腔，可見由髕骨下極向上延續有一層平滑光亮呈淡黃色的滑膜組織，完整剝離滑膜組織。采用蛋白印跡法，分別進行蛋白樣本提取制備，SDS-PAGE的制備，灌膠及上樣，電泳、轉膜、封閉，加入封閉液和一抗NF-κB、NLRP3及二抗（1∶5000）進行免疫反應，最后按0.1 mL/cm2的顯影液計算用量，將顯影液加在PVDF膜上，暗室曝光，進行顯影和圖像分析，以目的蛋白與作為內參的β-actin的密度比值作為蛋白的相對含量。

1.6 統計學方法采用SPSS 24.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數資料以率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠踝關節組織病理表現正常對照組大鼠關節組織有少量散在淋巴細胞浸潤。模型組大鼠關節組織與正常對照組大鼠比較，表現出關節炎的典型特點，有不同程度的充血、水腫及炎性細胞浸潤，部分出現滑膜細胞、滑膜纖維組織增生。陽性對照組與青藤堿各劑量組，滑膜炎癥明顯減輕，炎性細胞浸潤減少，血管翳形成減輕。病理評分結果顯示，與正常對照組大鼠比較，其余各組大鼠關節組織的病理改變積分顯著增高（P＜0.05），而陽性對照組、青藤堿各劑量組大鼠病理表現評分均較模型組明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠踝關節組織病理表現（HE×400）

2.2 關節炎指數造模后第21、28、35、42天，模型組大鼠的關節炎指數較正常對照組顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組及青藤堿各劑量組大鼠關節炎指數顯著降低（P＜0.05）；其中青藤堿高劑量組關節炎指數低于低劑量組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點大鼠關節炎指數變化（±s）

表1 各組大鼠不同時間點大鼠關節炎指數變化（±s）

注：#表示與正常對照組比較，P＜0.05；*表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與青藤堿低劑量組比較，P＜0.05；-表示無數值

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2.3 血清炎性因子水平模型組大鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-α、8-OHdG和MDA水平較正常對照組明顯升高（P＜0.05），表明造模成功。與模型組比較，青藤堿各劑量組血清中IL-18、IL-1β、TNF-α、8-OHdG和MDA水平顯著降低（P＜0.05）。與陽性對照組比較，青藤堿各劑量組血清炎性因子水平差異無統計學意義（P＞0.05）。與青藤堿低劑量組相比，高劑量組血清中IL-18、IL-1β、TNF-α、8-OHdG和MDA水平顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠血清細胞因子的表達變化

2.4 滑膜組織中NF-κB/NLRP3信號通路蛋白表達與正常對照組比較，其余各組大鼠滑膜組織中NF-κB/NLRP3通路相關蛋白的表達明顯上調（P＜0.05）。與模型組比較，青藤堿各劑量組NL‐RP3、ASC、IL-1β的表達、caspase-1/caspase-1的比率及IκB、NF-κB的磷酸化顯著下調（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠滑膜組織中NF-κB/NLRP3信號通路蛋白表達

3 討論

RA是一種全身性炎癥性疾病，主要表現為身體多關節慢性多發性關節炎、滑膜增生，最終導致功能喪失［12］。RA的病理進展與細胞因子介導的多關節炎癥密切相關，導致骨糜爛，甚至關節破壞［13］。然而，臨床可用藥物主要集中在控制疼痛或炎癥方面。目前，在治療自身免疫性疾病的臨床和實驗研究方面取得很大的進展。

CFA誘導的大鼠AA是一種實驗常用的多關節炎性實驗動物模型，大鼠AA表現為滑膜增生、慢性炎癥、軟骨和骨關節的進行性破壞［14-16］。此外，關節損傷主要是單核細胞浸潤所致，降解酶的合成與炎癥的產生AA表現為滑膜增生、慢性炎癥和軟骨、骨關節的進行性破壞［17］。此外，關節損傷主要是單核細胞浸潤所致。降解酶的合成及TNFα、白細胞介素等炎癥介質的產生IL-1β和IL-6［18］。TNF-α在關節損傷中起著至關重要的作用。RA患者滑膜增生的調解與生產關節炎侵蝕發

病因機制中的趨化因子。IL-1β是一種促炎性細胞子，可引起全身炎癥癥狀，過量的IL-6可促進骨吸收［19］。IL-1β和IL-6在體外可誘導產生TNF-α。本研究采用CFA誘導的大鼠AA模型，分別檢測了大鼠血清中IL-18、IL-1β和TNF-α水平以及8-OHdG和MDA含量［20］。結果表明，不同劑量的鹽酸青藤堿可顯著降低血清中IL-18、IL-1β、TNF-α、8-OHdG和MDA的水平，表明鹽酸青藤堿對AA具有較好的治療作用。青藤堿組與陽性對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），表明鹽酸青藤堿對AA的治療作用與雷公藤多苷相當。上述結果表明，鹽酸青藤堿可顯著抑制AA大鼠細胞因子以及氧化應激產物的合成和釋放。

巨噬細胞表達黏附分子、趨化因子受體（chemokine receptor，CR）和其他表面抗原，分泌趨化因子、細胞因子如IL-6、IL-1β、TNF-α及生長因子、蛋白酶和其他介質，這些炎癥介質是關節炎中炎癥和血管新生發生的重要病理機制。根據上述機制［21］，目前已開發出各種細胞因子類生物制劑如IL-1和TNF-α拮抗劑等，對風濕性關節炎具有一定療效，可有效改善RA患者臨床指標和生活質量［22］。然而，大規模臨床試驗顯示，現有的藥物只能緩解RA，并不能達到治愈的目的，且仍有許多RA患者對IL-1和TNF-α拮抗劑不敏感，療效不佳。

炎癥是清除體內危險刺激的一種防御反應，炎性小體通過促炎細胞因子的裂解并使其成熟來調節炎癥［23］。核苷酸結合NLRP3炎性小體是一種細胞質內的多蛋白聚合物，主要由NLRP3、ASC、Caspase-1組成，是天然免疫系統的重要組成部分［24］。NLRP3炎性小體參與Caspase-1的活化，促進炎性細胞因子IL-1β、IL-18、IL-33等促炎細胞因子的分泌，調節免疫應答和炎性反應。研究顯示［25］，激活NLRP3炎性小體需要兩個步驟：啟動信號，通過NF-кB途徑使NLRP3炎性小體和IL-1β前體轉錄。激活信號，微生物或者危險相關分子模式直接激活炎性小體［26］。

既往研究［27］認為，NLRP3炎性小體的過度激活在代謝性、心血管及肝臟疾病發病過程中起重要作用。而近年來的諸多研究表明，NLRP3炎性小體參與了RA的發病進程。NLRP3炎性蛋白的遺傳變異被證實與RA的易感性與嚴重程度密切相關，抗TNF藥物對RA的療效受NLRP3炎性小體遺傳變異的影響。值得一提的是，WANG等［28］在近來發現中國傳統中藥材仙茅苷A可抑制AA大鼠NFκB/NLRP3通路激活，降低血清中炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α、前列腺素E2和丙二醛表達?，F代藥理學亦證實，中藥有較強的消炎止痛作用，同時有免疫調節作用，可降低炎癥因子IL-1β、TNF-α改善炎癥狀況［29-30］；但尚不清楚NF-κB/NLRP3炎性小體通路是否參與了SN對RA的治療作用。