腸道干細胞衰老機制研究進展及針灸應用思考?

陳雅男，翁志軍，趙 琛，鄭寒丹，劉雅楠，李昆珊，陸 嫄，馬 喆，崔云華，△

1上海中醫藥大學，上海 201203；2上海市針灸經絡研究所

腸道干細胞（intestinal stem cells，ISCs）是成體干細胞定向分化出的一種具備終生自我更新與分化特性的細胞，位于Lieberkunn’s隱窩中。ISCs分化出的定向祖細胞分為五種：吸收細胞、杯狀細胞、內分泌細胞、M細胞、潘氏細胞。前四種都會向腸腔方向遷延，總稱為腸道上皮細胞（intestinal epithelial cells，IECs），因ISCs與IECs的生理關系比較緊密，所以經常將這兩類細胞一同分析描述。現就近年腸道干細胞衰老機制研究進展及相關針灸研究進行綜述。

1 影響腸道干細胞衰老的因素

腸道干細胞作為成體干細胞定向分化出的一種，具有自我更新并特化成為某種組織類型的細胞功能［1］。它在特定條件下，或者產生新的干細胞，或者按一定的程序分化，從而使器官和組織的細胞保持生長和衰退的動態平衡。

近年來，關于干細胞衰老的學說相繼被提出，其中具有代表性的有程序性衰老理論、自由基衰老學說、端粒損傷理論、DNA損傷學說、線粒體損傷學說、表觀遺傳修飾學說及熱量限制學說（caloric restriction，CR）。有學者［2］認為，生長因子、細胞因子和細胞外基質分子構成了一種供干細胞增殖與分化的微環境，同時分泌各種各樣的細胞因子，其產物是隨干細胞的衰老而變化的。表明微環境的衰老標志著系統環境的改變，干細胞的微環境在維持干細胞功能和調節衰老方面起著重要作用［3］。所以整個腸道的衰老變化對于研究腸道干細胞的衰老機制具有重要意義。研究［4］顯示，相對于年輕小鼠，衰老小鼠的小腸衰老表現在隱窩數量均勻減少，腸絨毛增大且數量減少，同時絨毛微血管結構也有改變。研究［5］發現，潘氏細胞的數量和分泌功能在成年之后隨著年齡顯著下降。

1.1 線粒體DNA損傷以及副產物對腸道干細胞的影響線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）具有調控細胞合成與凋亡［6］的作用。有學者認為，mtDNA由于被損傷及復制過程產生大量突變，導致氧化磷酸化能力下降，體內供能不足隨之發生衰老。哺乳動物的mtDNA通過氧化磷酸化反應（oxidative phosphorylation，OXPHOS）過程產能的同時會有副產物，其中一種就是自由基（reactive oxygen species，ROS），它是損害干細胞DNA完整性和穩定性的重要因素之一。大量研究［7-8］證實它參與了多種疾病的發生，且其與腫瘤和衰老的關系尤為密切。人體接觸紫外線和X射線及一些有毒化學物和某些食物都會生成ROS，這些誘因還可導致mtDNA等線粒體基因發生突變，抑制氧化磷酸化反應導致ROS增加，進而損害線粒體功能，促使細胞凋亡。當細胞死亡累積到一定程度時，器官功能衰退就會出現衰老表征［9］。ROS與其他新陳代謝所產生的有害產物都可被超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）清除，同時SOD還可抗阻ROS對細胞的傷害并及時進行修復［10］。反之，衰老機體中SOD清除自由基的能力減弱，也可間接促使細胞衰老［11］。

除了ROS的刺激因素，基因組在復制過程中往往會出現錯誤，為了糾正這些錯誤，人體內會產生與DNA損害相適應的細胞應答以修復細胞、減緩老化進程［12］。另外還有研究［13］發現，小鼠干細胞自噬異常可以導致蛋白質穩態丟失，增加線粒體的損傷與氧化壓力，使年輕的細胞加速衰老。

線粒體呼吸鏈（respiratory chain，RC）在線粒體DNA產生ATP的過程中扮演了重要的角色。臨床研究發現，在衰老的人體組織內，RC缺陷的干細胞增殖能力降低并增加后代的細胞凋亡率，導致腸隱窩細胞群減少。老年人的小腸干細胞的子代細胞由于呼吸鏈的缺陷導致增殖減少，凋亡增加［14-15］。

1.2 腸道干細胞衰老過程中端粒、端粒酶的研究觀察端粒（tolemere）是真核生物染色體末端的特殊結構，端粒隨著年齡增長縮短，這是一種經典的衰老機制。具有活性的端粒酶的存在意義就是延緩端粒長度的縮短速度。研究［16］發現，12個月的端粒酶基因敲除小鼠出現早衰現象，比如腸壁絨毛萎縮，甚至某些區域絨毛和黏膜扁平縮短。Klotho與端粒酶活性和端粒長度有關，可直接影響干細胞的衰老過程，并且認為干細胞功能障礙是由Klotho缺陷和端粒縮短引起的。

1.3 腸道干細胞衰老和表觀遺傳學說二者的關系表觀遺傳和干細胞衰老是機體衰老的兩個重要因素。表觀遺傳會通過調節染色質結構和狀態進而調節細胞衰老和壽命，影響基因表達。在衰老過程中，表觀遺傳的改變可導致干細胞損耗［17-18］。而干細胞損耗是導致多種組織發生衰老相關的生理病理學變化的重要原因。因此，表觀遺傳擁有控制干細胞建立以及維持的功能，所以干細胞的表觀遺傳失調可導致發生衰老和衰老相關疾病［19］。

1.4 相關信號通路對腸道干細胞衰老的影響“早熟性衰老”是干細胞衰老的一種形式，是指以外界刺激導致干細胞微環境的變化，阻滯干細胞增殖而衰老。這種形式與一些信號通路有密切聯系，其中Wnt信號通路在衰老的過程中有重要的調控作用［20］。研究證實，腸上皮細胞增殖的主要動力來源為Wnt通路，衰老時ISCs中Wnt信號傳導下降［21］，證實了該因素在衰老進程中的重要性［22］。另有研究表明，ISCs中主要減少的經典Wnt信號傳導導致機體衰老過程中ISCs功能衰退及Paneth細胞和間充質中Wnt3表達下調，可能促進衰老腸道干細胞中經典Wnt信號傳導活性的降低，繼而成為惡性循環［23］。可以推測，通過在老化的腸道干細胞中重新激活經典Wnt信號傳導可能是延緩衰老的作用機制之一［24］。

在 近 年 的 研 究［25-27］中 發 現，DNA損 傷 反 應（DNA damage response，DDR）和p53途徑［28-29］可能在Wnt/β-catenin信號通路激活導致干細胞的衰老的過程中發揮了重要作用。有學者［30］認為激活的DNA損傷反應可進一步激活p53途徑，也研究發現DNA損傷不依賴于p53，而是直接引發衰老［25］。這兩者的關聯現在還未完全闡明，還需繼續研究。

Insulin/IGF-1，簡稱IIS，是調節機體生命周期的一條通路［31］。研究［32］顯示，在秀麗隱桿線蟲編碼類似insulin/IGF-1的激素受體的基因daf-2可顯著延長壽命，不僅如此，影響IIS通路下游成分的突變也能延長壽命。在果蠅腸模型中研究發現抑制其腸道干細胞中的IIS通路可以延長壽命［33］，而機體進入衰老形態后，IIS失活，并且加速引起衰老［32］。當機體處于應激狀態時，細胞經常活化JNK信號通路以作為細胞保護應答，JNK的活化可引起干細胞增殖功能增強［34］，然而在此過程中，子代細胞的分化缺陷升高導致腸上皮功能受損［35］，需要限制以確保長壽。干細胞衰老的信號通路還有很多疑問，需要繼續研究。

1.5 熱量限制對腸道干細胞衰老的影響熱量限制在延緩機體衰老以及抵御年齡相關的疾病具有顯著效果［36］。其具體機制現有以下說法：禁食之后機體處于低熱量狀態，延緩年齡相關的細胞組織功能減退，所以認為低熱量狀態對年齡相關引起的組織功能減退具有抑制作用。有研究顯示，通過研究急性脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，FAO）幼鼠和衰老小鼠模型，發現它們的ISCs功能快速提升［37］。有學者［38］認為，FAO會造成丙酮酸氧化降低，這會增強腸道干細胞功能，另一種可能是低熱量狀態下線粒體衰老與線粒體代謝受損和FAO在許多組織中有關。研究［39］認為，高脂飲食直接影響了ISCs與祖細胞的功能，是通過過氧化物酶體增殖物激活受體δ，也稱為PPAR-d，信號傳導增強了腸道干細胞功能；表明熱量限制可以通過保留抗損傷儲備腸道干細胞池的方式增強腸上皮的再生能力［40］。

1.6 p53蛋白及其家族與腸道干細胞的關系p53蛋白是一種抑癌蛋白，與衰老和腫瘤的發生機制有著密切的聯系。研究發現，在細胞培養中，端粒功能失調誘導p53依賴性的DNA損傷檢查點，包括p21的依賴性衰老［41-42］。研究表明，p53對于衰老端粒功能失調小鼠的腸上皮完整性具有正向調節作用［43］；p53會消耗攜帶斷裂DNA和染色體畸變的腸道干細胞［44］；當DNA損傷至無法修復時，激活的p53上調促進凋亡蛋白表達和線粒體細胞色素C釋放并導致細胞凋亡［45］。上述p53介導的DNA損傷信號通路可防止DNA損傷在細胞內的積累，阻止新生癌細胞出現。從該角度而言，p53的腫瘤抑制作用對延長機體生命有重要作用，而高表達p53基因小鼠出現組織干細胞功能下降等各種早衰表型［46］。研究證明，p53誘導的凋亡和衰老可能通過損耗干細胞數目和功能影響老化進程［47］。有學者［48］也在果蠅中研究發現衰老過程中干細胞功能下降的同時增加了老化組織穩態的可能性。另有研究［49］發現，衰老機體中的干細胞中的p53蛋白除了抑制細胞增殖還具有抑制腫瘤因子表達的作用；干細胞中的p53被激活后，其介導的DNA損傷信號通路導致細胞周期出現不可逆的阻滯，引起干細胞的衰老和凋亡［50］。

p21基因與p53屬于同一家族，可以通過抑制周期素依賴激酶（Cyclin-dependent kinases，CDKs）復合物活性，將調控細胞周期與腫瘤抑制作用聯系起來并且在細胞出現適度DNA損傷時發揮修復作用。炎癥反應激活p53并介導細胞周期阻滯，激活的p53誘導CDK抑制劑p21基因轉錄，一般情況下可致細胞衰老［51］。同一家族的P16Ink4a與P19Arf（人類中的p14Arf）在衰老的機體中的表達也有所增加。

2 針灸與腸道干細胞衰老的關系

2.1 針灸延緩腸道干細胞衰老的研究思路《靈樞·九針十二原》篇云：“經脈十二，絡脈十五。”《靈樞·本藏》篇曰：“經脈者，所以行血氣而營陰陽，濡筋骨，利關節者也。”經絡的作用就是運行全身氣血、聯絡臟腑官竅、溝通上下內外。國內一些學者［52］認為經絡的巡行走向與干細胞巢的分布有著密切的關系，具體來說不同器官的干細胞巢的分布構成了經絡，刺激該臟腑的經絡可沿著循行走向到達病處進行修復。

不論在西方醫學還是中國傳統醫學理論中，衰老都是一種整體性的變化，腸道作為重要的消化器官，ISCs作為腸道上皮細胞的生長“基礎”，其衰老對于系統的老化進程有著不可忽視的影響。LEI等［53］研究發現，ISCs與腸上皮細胞下肌成纖維細胞有很緊密的聯系，主要表現為可以調節局部內環境繼而影響腸道干細胞。據這份研究結果可以推測，針灸調節腸道干細胞的影響因子繼而間接調節腸道干細胞衰老進程的研究。

2.2 針灸干預信號通路延緩腸道干細胞衰老近年來，針灸在信號通路層面對于機體正向性調節作用的研究較多，前面闡述了腸上皮細胞增殖主要的動力來源是Wnt通路激活，增殖的來源是腸道干細胞，所以腸道干細胞衰老、機體系統性衰老和Wnt信號通路被抑制激活這三者相互影響。JNK通路上調導致干細胞增殖增加的過程中，相關干細胞的子代細胞分化出的缺陷明顯增加，可使腸上皮細胞功能受損。前面提到導致衰老是一種協同作用，而同種延緩衰老的干預方式也可能同時在不同的通路中發揮了作用，如果將針灸作為干預ISCs中Wnt信號通路的手段，可能會發現其延緩衰老的作用機制。

2.3 針灸干預衰老腸道炎性環境延緩腸道干細胞衰老有學者［54-55］認為腸道的衰老過程伴隨著慢性、低度的炎癥狀態。因此腸道內環境發生不平衡且持續的損傷，影響機體的衰老；針灸在細胞-體液免疫方面的調節機制主要表現在調整機體的免疫功能，使衰老過程中免疫功能得以趨近于正常［56］。故為針灸延緩衰老提供了依據，這種炎癥狀態可能對ISCs有一定影響，所以理論上針灸可以延緩腸道的衰老過程。

3 小結

自古以來，延緩衰老都是人類的共同希望，針灸不僅在中國傳統醫學中具有舉足輕重的地位，而且在延緩衰老方面具有獨特的優勢。近年來有關研究很多，然而已有的研究尚未涉及到腸道干細胞的層面中，當然，已經有越來越多的實驗證明一些單獨的機制學說之間有著千絲萬縷的聯系。但是關于針灸干預腸道干細胞衰老的機制研究方面還是空白，所以從該角度入手研究，可能會有新的發現，從而為人類抗衰老、延緩衰老研究進程提供一條途徑。