柴胡皂苷d對蟾蜍離體坐骨神經干電生理特性的影響?

羅 林，徐婷婷，陳 衛，楊春艷，張建武

川北醫學院，四川 南充 637100

柴胡皂苷d（Saikosaponin d，SSd，C42H68O13）是從傘形科植物柴胡Bupleurum ChineseD C.和狹葉柴胡Bupleurum scozonerifoliumWilld.干燥根中提取的一類皂苷類單體成分，是柴胡主要化學指標和生物活性成分之一［1］。近年來國內外研究表明，SSd具有抗腫瘤［2］、抗炎［3］、保肝［4］、免疫調節［5］、雌激素樣作用［6］等多種藥理作用，同時還有一定的毒性作用［7］，但SSd對外周神經系統的影響及其機制報道較少。為進一步完善SSd的作用機制，本研究從電生理學的角度探討SSd對蟾蜍離體坐骨神經干動作電位的影響，為臨床應用提供一定的電生理實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取活躍、皮膚濕潤、膚色均勻灰暗的中華蟾蜍40只，體質量（50±5）g，雌雄兼用，由川北醫學院動物實驗中心提供，實驗動物許可證號：SYXK（川）2018-076。飼養條件：常規條件下飼養于川北醫學院動物實驗中心。

1.2 試劑與儀器SSd（CAS：20874-52-6，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），純度≥98%；標準任氏液（NaCl 6.5 g，KCl 0.14 g，CaCl20.12 g，NaHCO30.20 g，NaH2PO40.01 g，加蒸餾水至1000 mL，所用試劑均為化學純品，成都科龍化工試劑廠提供；BL-420F生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）；AC0033型神經屏蔽盒（成都泰盟電子有限公司）；AC0047型刺激電極（成都泰盟電子有限公司）；引導電極（成都泰盟電子有限公司，AC0043）；常用蛙類手術器械：蛙足釘（成都泰盟電子有限公司，AC0012）、蛙板（成都泰盟電子有限公司，AC0014）；電子天平ES6000-1（沈陽龍騰電子有限公司）；記錄顯示設備（聯想公司）；優普純水/超純水制造系統（四川優普超純科技有限公司）；加樣槍（芬蘭biohit）。

1.3 實驗方法

1.3.1 試藥制備60 kg柴胡在60℃條件下，用丁柱工業甲醇提取3次。然后依次用二氯甲烷和正醇萃取，將所得2.1 kg正丁醇萃取物進行硅膠層析，依次用12∶1的二氯甲烷∶甲醇及二氯甲烷∶甲醇∶水的溶劑系統按照極性由小到大進行梯度洗脫，薄層層析合并得到9個組分。利用其制備高效液相色譜，采用80%甲醇對組分4（170 g）進行反相制備（10 cm柱，流速280 mL/min，檢測波長：203 nm），得到3個組分；用42%乙腈對組分3即CH-4-3（21 g）進行反相制備純化（10 cm柱，流速280 mL/min，檢測波長：203 nm），得到化合物1（18.11 g）。采用1H-NMR和13C-NMR對該化合物進行結構鑒定，通過解析圖譜發現該化合物1與文獻 報 道 基 本 一 致［8］，故 鑒 定 該 化 合 物1為SSd。

1.3.2 分組及處理 預熱電子天平30 min后，精確稱量所取SSd，并按照所取質量分別加入相應任氏液配置成陽性組所需試劑。基于預實驗的前提下，陽性組按照SSd溶液的濃度分為SSd 18、36、72 μmol/L，對照組則選用同一來源的任氏液作為實驗試劑。隨機選取制備好的蟾蜍離體坐骨神經干標本分配至對照組及各陽性組，運用加樣槍準確抽取200 μL相應試劑，小心滴至刺激電極和引導電極之間的神經干上，待藥物充分作用后，檢測動作電位相關參數。每次給藥前進行充分搖勻再用加樣槍抽取試劑，以防局部濃度不均導致實驗誤差。

1.3.3 標本制備 將蟾蜍進行稱重，破壞其腦和脊髓，剪除軀干上部及內臟，剝皮并分離左右腿，游離出3～5 cm的坐骨神經干，盡量將神經干周圍的組織剔除干凈，神經干脊柱端和足端用棉線結扎。然后將制備好的標本浸入任氏液中孵育10 min［9］。

1.4 觀察指標分別將制備好的坐骨神經干標本置于神經屏蔽盒的電極上，中樞段接刺激電極，外周端接引導電極，測定加藥前動作電位的閾強度、振幅、傳導速度及不應期。保持神經干在電極上放置的位置不動，在刺激電極和引導電極之間的神經干上滴入相應濃度的SSd溶液，蓋上神經屏蔽盒蓋子以防止水分蒸發和電磁波干擾，用BL-420F生物機能實驗系統每隔5 min檢測動作電位的相關值，分別檢測藥物作用后5、10、15、20 min的4個時間點。

1.4.1 神經干動作電位閾強度測定 選擇BL-420F生物機能實驗系統實驗項目菜單下肌肉神經實驗欄中“閾強度與動作電位的關系”，設置起始刺激強度為0.25 V，刺激強度增量為0.01 V，刺激間隔為1 s，程控記錄第1個動作電位出現時的刺激強度即為閾強度。

1.4.2 神經干動作電位幅度的測定 調整刺激強度為1.5 V，刺激脈沖寬度為0.3 ms，單刺激，由一對引導電極引導出復合動作電位，輸入BL-420生物信息采集及處理系統，采用系統的區間測量工具分別測量動作電位上相頂點和下相最低點之間的幅度（mV）。

1.4.3 神經干動作電位傳導速度的測定 測量第1對引導電極所測出的動作電位上相頂點到第2對引導電極所測出的動作電位上相頂點的時間（ms），同時直尺測量神經屏蔽盒中第1對引導電極中點與第2對引導電極中點之間的距離（mm），據此計算動作電位的傳導速度（m/s）。

1.4.4 神經干動作電位不應期的測定 選擇BL-420F生物機能實驗系統實驗項目菜單下肌肉神經欄中“神經干不應期的測定”。設置程控，雙刺激，啟示波間隔為10 ms，刺激逐漸減量，記錄每兩個連續刺激中第2個動作電位正相波消失時的波間隔時間為不應期。

1.5 統計學方法采用SPSS 19.0進行數據錄入和管理分析，計量資料以±s表示，采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經干動作電位閾強度3種濃度的SSd處理后均使得蟾蜍離體坐骨神經干復合動作電位的閾強度不斷減小。與加藥前比較，18 μmol/L組在加藥后10 min出現統計學差異（P＜0.05），36 μmol/L組和72 μmol/L組在加藥后5 min即出現統計學差異（P＜0.05），并且隨著SSd作用時間的延長，差異性愈加顯著（P＜0.01）；而任氏液組隨作用時間的延長并未出現統計學差異（P＞0.05）。表明不同濃度的SSd溶液均能使蟾蜍離體坐骨神經干復合動作電位的閾強度減小，且藥物濃度越大，對動作電位閾強度產生的影響越大；同時提示SSd對動作電位閾強度的作用效果與作用時間存在明顯的正相關關系。見表1。

表1 各組蟾蜍離體坐骨神經干動作電位閾強度比較（±s） mV

表1 各組蟾蜍離體坐骨神經干動作電位閾強度比較（±s） mV

注：與同組加藥前比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

?

2.2 神經干動作電位幅度3種濃度的SSd處理后均使得蟾蜍離體坐骨神經干復合動作電位的幅度不斷增大。與加藥前相比，18 μmol/L組和36 μmol/L組在加藥后5 min出現統計學差異（P＜0.05），72 μmol/L組在加藥后5 min即出現顯著性差異（P＜0.01），并且隨著SSd作用時間的延長，各實驗組數據比較差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.001）；而任氏液組隨作用時間的延長并未出現統計學差異（P＞0.05）。表明不同濃度的位SSd溶液均能使蟾蜍離體坐骨神經干復合動作電的幅度增大，并且藥物濃度越大，對動作電位幅度產生的影響越大；同時提示SSd對動作電位幅度的作用效果與作用時間存在明顯的正相關關系。見表2。

表2 各組蟾蜍離體坐骨神經干動作電位幅度比較（±s） mV

表2 各組蟾蜍離體坐骨神經干動作電位幅度比較（±s） mV

注：與同組加藥前比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001

?

2.3 神經干動作電位傳導速度3種濃度的SSd處理后均使得蟾蜍離體坐骨神經干復合動作電位的傳導速度不斷增大。與加藥前相比，18 μmol/L組在加藥后20 min出現統計學差異（P＜0.05），36 μmol/L組在加藥后10 min出現統計學差異（P＜0.05），72 μmol/L組在加藥后10 min即出現統計學差異（P＜0.01），并且隨著SSd作用時間的延長，各實驗組數據比較差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.001）；而任氏液組隨作用時間的延長并未出現統計學差異（P＞0.05）。表明不同濃度的SSd溶液均能使蟾蜍離體坐骨神經干復合動作電位的傳導速度增大，并且藥物濃度越大，對動作電位傳導速度產生的影響越大；同時提示SSd對動作電位傳導速度的作用效果與作用時間存在明顯的正相關關系。見表3。

表3 各組蟾蜍離體坐骨神經干動作電位傳導速度比較（±s） m/s

表3 各組蟾蜍離體坐骨神經干動作電位傳導速度比較（±s） m/s

注：與同組加藥前比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001

?

2.4 神經干動作電位不應期3種濃度的SSd處理后蟾蜍離體坐骨神經干復合動作電位的不應期相較于加藥前有小幅度的縮短，但差異無統計學意義（P＞0.05）；任氏液組隨作用時間的延長，與給藥前比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組蟾蜍離體坐骨神經干動作電位不應期比較（±s） m

表4 各組蟾蜍離體坐骨神經干動作電位不應期比較（±s） m

?

3 討論

近年來越來越多的國內外學者投身于SSd的研究，SSd的抗脂質過氧化、抗腫瘤、調節免疫等作用被逐漸發掘，涉及領域也不斷擴展［10］。但柴胡皂苷對坐骨神經干的藥理作用尚無報道，因此本研究就SSd對蟾蜍離體坐骨神經干動作電位的影響進行了探討。神經細胞興奮的標志是產生動作電位，動作電位一旦爆發即以一定的幅值迅速沿細胞膜向周圍擴布［11］。而動作電位形成的離子基礎主要是Na+和K+，神經細胞在靜息電位基礎上接受有效刺激后，Na+通道的通透性增大，Na+瞬間大量內流，出現去極化，當去極化達到閾電位水平時，膜發生的去極化與Na+電導之間形成正反饋，使膜電位出現爆發性去極化，形成動作電位陡峭的升支，隨后K+通道開放，大量K+外流出現復極化，形成動作電位的降支，兩者共同形成尖峰狀的峰電位。峰電位是動作電位的主要部分，被視作動作電位的標志。因此神經細胞產生動作電位的能力與閾電位的水平有著必然聯系，而影響閾電位水平的主要因素是電壓門控鈉通道在細胞膜中的分布密度、功能狀態以及細胞外的Ca2+水平［12］。

本實驗結果表明，用SSd處理后的蟾蜍離體坐骨神經干其閾強度相較加藥前明顯減小，而且呈明顯的劑量依賴性。在實驗中，本課題組嚴格控制實驗變量，選取來自同一總體的蟾蜍，在實驗過程中均采用標準任氏液，實驗結果顯示任氏液作用于坐骨神經干后并未引起統計學差異，而細胞膜上鈉通道的分布密度在短時間內變化不大，因此可以認為鈉通道的分布密度和細胞外的Ca2+水平的變化均無統計學意義，SSd僅通過作用于細胞膜鈉通道的功能狀態從而影響動作電位的形成。故本研究結果推測SSd有可能通過與神經細胞膜上多個靶點結合而改變細胞膜Na+通道的性狀，使Na+通道處于高敏狀態，細胞膜對Na+的通透性增大，故引起動作電位的刺激閾強度降低。同時Na+通道處于高敏狀態時，Na+內流量也會增加，從而導致動作電位幅度增加［13］，這與本實驗的實驗結果也是相符的。神經纖維上，動作電位是以神經沖動的方式進行傳導的。動作電位的幅度增大后，興奮區與未興奮區形成的局部電流增強，神經沖動在神經纖維上的傳導加快［14］，這與SSd作用后使坐骨神經干傳導速度加快的實驗結果也是一致的。SSd的濃度越高，浸泡的時間越長，Na+通道處于高敏狀態的數量就越多，以上現象也更明顯，這與實驗所表現出的濃度依賴性和時間依賴性一致。

神經細胞一次興奮后要經過一定時間的（絕對不應期）恢復，才能爆發新的興奮。此恢復時間的長短不僅取決于Na+-K+泵的轉運時間，而且與電壓門控Na+，K+通道的開放速度和開放時的電導率有關［15］。實驗結果表明，運用SSd作用于坐骨神經干后能小幅度的縮短動作電位的不應期，但沒有統計學意義，說明SSd可能不具備對上述途徑的藥理作用，亦可能是限于設備精度原因，本課題組無法精確測量動作電位不應期的變化，出現了假陰性結果。

綜上所述，筆者認為SSd減小蟾蜍離體坐骨神經干動作電位的閾強度，增大其動作電位幅度，加快神經干的傳導速度可能是通過與神經細胞膜上多個靶點結合而改變細胞膜Na+通道的性狀，使Na+通道處于高敏狀態，增大了細胞膜對Na+的通透性有關，但其具體機制仍有待于更進一步研究。