基于網絡藥理學分析荊芥—防風藥對的分子作用機制?

吳春鳳，黃艷霞，鄭景輝

1柳州市人民醫院，廣西 柳州 545006；2廣西中醫藥大學瑞康醫院

荊芥和防風是經典的祛風解表藥對，以其作為君藥的眾多復方廣泛用于呼吸系統疾病、皮膚病的治療。荊芥味苦性溫，歸肝肺經，善祛風解表、透疹、止血［1］。藥理研究表明，其有效成分揮發油、黃酮類及萜類化合物具有解熱［2］、抗炎［3-4］、鎮痛［5］、抗菌抗腫瘤［6-7］等作用。防風味辛、甘，歸肝、脾、膀胱經，具有祛風解表、勝濕止痛、止痙等作用，臨床常用于治療外感表證、風疹瘙癢、風濕痹痛等［8］。藥理研究表明，防風具有抗炎［9］、鎮痛、鎮靜［10］、抗腫瘤［11］、調節機體免疫、抗血栓［12］等作用。荊芥與防風有相似的藥理作用，兩藥相須為用，相輔相成，共奏發寒散邪之功。研究表明，表邪是外邪侵入人體肌膚所引起的癥候群，即上呼吸道感染和傳染病初期的癥狀。研究證實，解表藥的解表功效與抗炎作用相類似，而病毒屬于中醫學六淫范疇，是引起表證的主要病因之一，因此解表藥的藥理作用研究主要體現在抗炎、抗病毒及抗過敏方面［13］。藥理學研究證實了荊芥-防風藥對具有解熱、鎮痛、抗炎、抗菌、抗病毒等作用，而對其為什么能解除表證的研究尚不能全面、深入闡釋其作用機制。本研究以系統生物學為指導，應用網絡藥理學技術，從整體水平上分析“藥物-靶點”“靶點-靶點”“分子-細胞-生物過程-信號通路”復雜網絡關系，推導荊芥與防風這組藥對祛風解表的可能作用機理，為利用現代科學方法、豐富和發展中醫藥，實現中藥現代化提供參考。

1 資料與方法

1.1 對荊芥-防風藥對化學成分的收集及活性化合物的篩選從中藥系統藥理學數據庫（traditional Chinese medicines systems pharmacology platform，TCMSP）（http：//lsp.Nwsuaf.Edu.cn/tcmsp/php），檢索荊芥-防風藥對的化學成分，篩選出口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18［14-15］，的候選化合物成分，作為荊芥-防風藥對的活性化學物。

1.2 收集荊芥-防風活性化合物的靶點蛋白及構建化合物-靶點蛋白網絡圖通過TCMSP和DrugBank數據庫，檢索荊芥-防風藥對活性化合物的靶點蛋白，將預測靶點蛋白導入UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/），檢索并剔除重復、非人源靶點，并轉化為活性化合物規范的靶點蛋白的基因標識符（gene symbol）。將荊芥-防風藥對活性化合物及其對應靶點蛋白信息導入Cytoscape 3.7.0軟件，進行可視化并計算網絡拓撲學參數，構建荊芥-防風活性化合物-靶點網絡。

1.3 構建靶點蛋白相互作用網絡圖（protein protein interaction，PPI）將荊芥-防風藥對活性化合物的靶點蛋白輸入STRING 10.5在線軟件（http：//string-db.org）檢索框中，限定研究物種為“Homo spaiens”，設置打分值高于0.9的最高置信度的數據，獲得PPI及互作信息，將結果導入Cytoscape 3.7.0（http：//www.Cytoscape.org/）軟件進行可視化及網絡拓撲學分析，PPI圖中節點的顏色、大小反應節點Degree值，邊的顏色、粗細反映節點間Combined score值。本研究基于以下參數：平均最短路徑（average shortest path length，ASPL）、介數中心性（betweenness centrality，BC）、中心接近度（closeness centrality，CC）、聚類系數（clustering coefficient，CC）、連通度（degree），以評估節點在網絡中的重要程度。

1.4 基因本體（gene ontology,GO）及信號通路分類將荊芥-防風活性化合物靶點上傳到David數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/），以人類全基因組為背景基因和參照集合，進行GO的生物學 過 程（biological process，BP）、細 胞 組 成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）功能富集分析和KEGG信號通路分析。利用Cytoscape 3.7.0軟件計算出富集因子并繪制氣泡圖。

2 結果

2.1 化學成分及活性成分篩選在TCMSP數據庫中檢索出與荊芥有關的化學成分有159種，與防風相關的化學成分有173種，兩者含有31種相同成分，故而從荊芥-防風藥對共檢索出相關化學成分301種。通過口服生物利用度和類藥性分析發現：在荊芥和防風中，分別有11、18種化合物表現出良好的口服生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18），其中β-谷甾醇（beta-sitosterol）和谷甾醇（sitosterol）為荊芥和防風共有化合物，故荊芥-防風藥對共篩選出27種活性化合物。見表1。

表1 通過OB和DL預測的荊芥-防風中的27種活性化合物信息（荊防散有效成分表）

2.2 化合物-靶點相互作用網絡分析在TCMSP和DRUGBANK數據庫中分別檢索“荊芥-防風”藥對27種活性化合物的相關靶點蛋白，其中槲皮素（quercetin）相關靶點最多（154個），其次是木犀草素（luteolin）靶點57個、β-谷甾醇（beta-sitosterol）靶點46個、漢黃芩素（wogonin）靶點45個、豆甾醇（stigmasterol）靶點31個，而角鯊烯（supraene）在上述兩個數據庫中還未有相關靶點?？偣矙z索出509個靶點，剔除重復的、非人源的靶點，結合Uniprot數據庫確認及轉換，最終共得到208個靶點。利用Cytoscape軟件構建“荊芥-防風”藥對活性化合物-靶點相互作用網絡，網絡中包含234個節點（2個化合物和208個潛在靶標）和504條邊。在網絡中，粉色節點代表靶點，藍色節點代表化合物，一個節點的度（degree）表示網絡中和節點相連的路線的條數。經過Network analysis分析，得出208個靶點在網絡中的度（degree），其中前列腺素過氧化物合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）度值最大（23），其次為絲氨酸蛋白酶（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）、F2（prothrombin，F2）、HSP90（heat shock protein HSP 90-alpha，HSP90）、PTGS1（prostaglandin G/H synthase 1，PTGS1）、NCOA2（nuclear receptor coactivator 2，NCOA2）、SCN5A（sodium channel protein type 5 subunit alpha，SCN5A）等，這些度值（連通度）高的藥物化合物度值越大，在荊芥-防風藥對的藥理功能中發揮重要作用的可能性越大。見圖1。

圖1 荊芥-防風藥對化合物成分-作用靶點網絡圖

2.3 潛在靶點的拓撲學分析將208個潛在靶點導入string軟件中構建PPI網絡，將得到的蛋白互作網絡導入Cytoscape軟件進行網絡拓撲屬性分析。荊芥-防風藥對潛在靶蛋白PPI網絡有118個節點（90個靶蛋白未參與蛋白的相互作用），經計算后可知，平均連通度約為4.068，平均最短路徑長度為3.074，平均介數約為0.058，平均聚類系數約為0.314。度值大的節點被認為是中心節點，其中度值超過平均數的節點有35個，說明這35個節點作為蛋白互作網絡中的核心節點，可能是荊芥-防風藥對化合物作用的關鍵靶標。見圖2、表2。

表2 荊芥-防風藥對潛在靶點的網絡拓撲屬性

圖2 荊芥-防風藥對化學成分靶點蛋白的PPI網絡圖

續表2

2.4 荊芥-防風藥對作用關鍵靶點的GO分析和KEGG分析將荊芥-防風藥對35個關鍵靶點導入David數據庫進行GO分析和KEGG分析。經過Bonferroni校正P值小于0.05，GO富集分析得到127個生物學過程，包括一氧化氮生物合成過程的正調控、對藥物的反應、凋亡過程的負調節、DNA模板轉錄的正調控、對乙醇的反應等；20個細胞組成，包括核漿、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物、細胞質、細胞外間隙、細胞液等；31個分子功能，包括識別蛋白結合（identical protein binding）、細胞因子活性（cytokine activity）、酶結合（enzyme binding）、一氧化氮合成酶調節活性（nitric-oxide synthase regulator activity）、蛋白質復合物結合（protein complex binding）等，GO分析注釋見圖3。KEGG通路富集分析顯示荊芥-防風藥對35個關鍵靶點涉及80條信號通路，包括：腫瘤信號通路（tumor signaling pathways）、乙肝病毒（hepatitis B）、膀胱癌（bladder cancer）、I型人類嗜T細胞病毒感染（HTLV-I infection）、小細胞肺癌（small cell lung cancer）、胰腺癌（pancreatic cancer）、PI3K-Akt信號通路（PI3KAkt signaling pathway）、p53信 號 通 路（p53 signaling pathway）等。荊芥-防風藥對的作用靶點涉及多種生物過程及多條通路，說明荊芥-防風藥對可以通過調節這些生物過程和通路來發揮治療作用。見圖3—4。

圖3 荊芥-防風作用靶點的GO分析

2.5 荊芥-防風藥對作用關鍵靶點生物學過程及信號通路聚類分析對荊芥-防風藥對的35個關鍵靶點參與機體的生物學過程進行聚類，可將其大致分為細胞代謝過程、血管生成和收縮、炎癥反應、免疫反應和氨基酸磷酸化的調控等。荊芥-防風藥對的35個關鍵靶點作用的信號通路共富集出80條，包括癌癥信號通路、PI3K/AKT信號通路、P53信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路、T細胞受體信號通路等，且這些通路是多個靶點共同調控的，如35個關鍵靶點中有16個靶點（PTEN、CDK2、AKT1、CCN D1、CDKN1A、VEGFA、NOS3、MYC、IL2等）富集在PI3K/AKT信號通路上，見圖5。推測荊芥-防風可能通過這些關鍵靶點參與到炎癥反應、免疫反應等生物學過程和調控相關通路發揮治療作用。見圖5。

圖5 荊芥防風藥對16個關鍵靶點在PI3K/AKT信號通路中的分布圖

圖4 荊芥-防風藥對有效化合成分作用的核心靶點的KEGG分析氣泡圖

3 討論

本研究采用網絡藥理學方法對荊芥和防風的主要活性成分、作用的靶點、參與的生物學過程及靶點涉及的信號通路進行了探討。根據ADME利用TCMSP數據庫找尋到荊芥-防風藥對共27種有效活性成分，其中槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、漢黃芩素、豆甾醇等可能是荊芥-防風發揮療效的主要活性成分。槲皮素作為一種廣泛存在于自然界的天然黃酮類化合物，具有多重生物活性，有抗氧化、抗病毒、抗炎等作用，在細胞和動物實驗中可以用來治療肝、心、脾、肺、腎、骨髓系統、神經系統疾病等［16］。木犀草素有抑菌抗病毒、降血糖血脂的功效，在免疫調節、鎮痛抗炎、抗腫瘤方面有良好的效果［17］。漢黃芩素是一種來源于純天然中草藥的黃酮類化合物，近年來，漢黃芩素在抗腫瘤和免疫調節方面的作用得到了關注，CUSICK等［18］用小鼠腦脊髓炎病毒（Theiler's murine encephalomyelitis virus，TMEV）建立C57BL/6小鼠中樞神經系統感染的模型，在小鼠感染病毒24 h后分別用漢黃芩素和抗中樞神經系統感染藥米諾環素進行腹腔注射，發現二者均能夠明顯減少小鼠大腦中巨噬細胞的浸潤。由此推測荊芥防風通過這些有效活性成分發揮抗炎、抗病毒等作用。對荊芥防風的作用靶點進行拓撲屬性分析后，篩選出來35個關鍵靶點，這些靶點參與了機體眾多生物學過程，聚類后大致分為細胞代謝過程、血管生成和收縮、炎癥反應、免疫反應和氨基酸磷酸化的調控等。富集出來的通路有80條，包括癌癥信號通路、PI3K/AKT信號通路、P53信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路、T細胞受體信號通路等，并且這些通路是多個靶點共同調控的，如PTEN、CDK2、AKT1、CCND1、CDKN1A、VEGFA、NOS3、MYC、IL2等16個靶點富集在PI3K/AKT信號通路上。推測荊芥防風可能通過這些關鍵靶點參與到炎癥反應、免疫反應等生物學過程和調控相關通路，發揮治療作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法探討了荊芥-防風藥對的有效活性成分、關鍵的作用靶點和參與的生物學過程以及信號通路，與現代藥理研究相符，本研究是通過現有的文本挖掘和大數據來進行預測，研究可能存在一些局限性，如數據庫不夠完整、評判標準不一的問題，因此，后期有必要通過基礎實驗加以完善。