耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌流行病學調查與耐藥性分析

李少媚 吳森泉 張嘉文 賴應昌 黎雪晶 姜義榮▲

1.廣東省東莞市人民醫院血液淋巴瘤科，廣東東莞 523000；2.廣東省東莞市人民醫院呼吸與危重癥醫學科，廣東東莞 523000；3.廣東省東莞市人民醫院檢驗科，廣東東莞 523000

耐碳青霉烯類腸桿菌（carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE）包含70多種細菌，該類腸桿菌科細菌能夠產生碳青霉烯酶進而對碳青霉烯類抗生素產生耐藥性[1]。自2001年首例攜帶肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（klebsiella pneunwniae carbapenemase，KPC）的CRE被報道，世界范圍內關于CRE感染的報道越來越多見[2]。目前市面上絕大多數抗菌藥物對CRE的抗菌活性均較差，無藥可用成為CRE感染者死亡的重要原因，而隨著臨床碳青霉烯類抗生素應用的增加，進一步增加CRE的檢出率[3]。本研究回顧性分析2014年1月至2019年12月東莞市人民醫院CRE耐藥情況，以期為臨床用藥及院感防控提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

收集2014年1月至2019年12月東莞市人民醫院送檢標本中分離的83株耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細菌，標本共對應83例臨床患者，年齡1～85歲，平均（56.25±6.75）歲。質控菌株為肺炎克雷伯菌（批號：ATCC 700579/ BAA-1805）、大腸埃希菌（批號：ATCC 25799）。

1.2 藥敏分析及菌種鑒定

采用VITEK-2 型全自動微生物分析系統（法國生物梅里埃公司）對進行菌種鑒定及藥敏分析，參照美國臨床和實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S27 標準[4]進行結果判讀，使用改良Hodge試驗（modified Hodge test，MHT）[5]對待測菌碳青霉烯酶陽性情況進行檢測，試驗陽性即提示該菌株產碳青霉烯酶。

1.3 碳青霉烯酶基因檢測

制備模板DNA（煮沸法），以聚合酶鏈式反應（PCR）擴增碳青霉烯酶基因；擴增體系為Premix Taq（大連寶生物工程有限公司）50 μl，引物各 1 μl，Premix Taq 25 μl，滅菌雙蒸水 21 μl，模板2 μl。反應條件：①blaIMP：置于94℃下變性5 min、94℃變性 45 s、55.5℃變性 45 s、72℃變性 1 min，30個循環后，于72℃下延伸10 min；②blaVIM：置于 94℃下變性 5 min、94℃變性 45 s、56℃變性 45 s、72℃變性1 min，30個循環后，于72℃下延伸10 min；③blaKPC：置于94℃下變性5 min、94℃變性1 min、56℃變性 1 min、72℃變性 1 min，30 個循環后，于 72℃下延伸10 min；④blaOXA-48：置于94℃下變性5 min、94℃變性 45 s、48.5℃變性 45 s、72℃變性 1 min，32 個循環后，于72℃下延伸5 min。采用UVP一體化凝膠成像系統（美國GelDoc-ItTS3）對PCR產物進行分析。各基因對應引物序列及產物長度見表1。

表1 碳青霉烯酶基因引物序列

1.4 統計學處理

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，采用t檢驗；計數資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗；采用WHONET 5.6進行耐藥性分析。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菌株來源分析

83株CRE標本來自尿液33株（39.76%）、痰液 16株（19.28%）、血 液 15株（18.07%）、膽 汁4株（4.82%）、分泌物8株（9.64%）、鼻腔拭子 1株（1.20%）、支氣管肺泡灌洗液1株（1.20%）、腹水1株（1.20%）、糞便1株（1.20%）、其他3株（3.61%）；其中尿液、痰液、血液中CRE菌株占比最高，三種途徑菌株共計64株，占總數的77.11%（64/83）。

2.2 CRE菌種分布分析

83株CRE當中肺炎克雷伯菌（36株）、大腸埃希菌（20株）、陰溝腸桿菌（14株）占比最高，三種病原菌共計70株，占總數的84.34%（70/83）。見表2。

表2 CRE菌種分布

2.3 碳青霉烯酶基因檢測結果

36株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌中檢出攜帶碳青霉烯酶基因的菌株共31株，檢出率為86.11%（31/36），其中 blaKPC 30株、blaVIM 4株、blaIMP 4株、blaOXA-48 0株，檢出率分別為83.33%、11.11%、11.11%、0；檢出率最高的碳青霉烯酶基因為KPC（30株），檢出率高達83.33%。有一例同時攜帶KPC、VIM、IMP三種碳青霉烯酶基因，有3例同時攜帶IMP、KPC，有1例同時攜帶VIM、KPC。部分KPC基因的結果見圖1。

圖1 部分KPC基因的結果

2.4 CRE耐藥性分析

耐藥性分析結果顯示對CRE敏感率最高的三種抗菌藥物為阿米卡星、慶大霉素、呋喃妥因，敏感率分別為69.88%、37.35%、37.35%；有6種抗菌藥物（氨芐西林/舒巴坦、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢唑啉、亞胺培南、厄他培南）對CRE的敏感率為0，有2種抗菌藥物（氨芐西林、頭孢替坦）對CRE的敏感率＜ 10.00%。見表3。

表3 CRE耐藥性分析

3 討論

碳青霉烯類抗生素是目前臨床抗菌效果最好、抗菌譜最廣的一類抗生素，被認為是治療多重耐 藥 菌（multi-drug resistant bacteria，MDROS）感染的最有效藥物，大大提高了MDROS感染患者生存率及預后水平。盡管碳青霉烯類抗生素對大部分MDROS具有良好抗菌活性，但CRE卻對其余大部分抗生素具有耐藥性，因此臨床又稱其為“超級細菌”[6-8]。人體感染CRE后病原菌會侵入人體組織及血液，并在體內不斷繁殖導致體內正常細胞組織死亡而引起人體組織、器官出現功能障礙和炎癥反應。長期使用各類抗生素進行治療的患者體內病原菌發生變異的概率更高，因此這部分患者感染CRE的風險也更高[9-10]。人體一旦發生CRE感染，由于缺乏有效抗菌藥物，后果往往較為嚴重，因此，臨床為提高這部分感染者的治療效果通常主張采用多種抗菌藥物聯合使用以盡早殺滅病原菌，提高患者預后水平。

大量研究證實CRE對市面上絕大多數抗菌藥物均具有耐藥性，其對哌拉西林/他唑巴 坦（tazobactam-piperacillin，TZP）、氨 曲 南（Aztreonam，ATM）等常見抗生素的耐藥率達到 90% 以上，對頭孢他啶（Ceftazidime，CAZ）、頭孢西?。╟efoxitin，FOX）等的耐藥率也高達80%以上，無藥可用也使得CRE感染者具有較高的病死率[11-13]。而本研究耐藥性分析結果顯示，TZP、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢唑啉、亞胺培南、厄他培南對CRE的敏感率為0，氨芐西林、頭孢替坦對CRE的敏感率＜10.00%，這與既往研究結果基本一致，這也進一步驗證了CRE對抗菌藥物的高耐藥性[14-15]。此外，本研究結果還顯示，肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌三種病原菌占總菌株的比值高達84.34%，而其中以肺炎克雷伯菌最多，臨床可通過對上述三種CRE病原菌進行針對性研究以降低CRE感染率，提高CRE感染者治療效果。本文主要針對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌進行耐藥性基因檢測，結果顯示，36株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌中檢出攜帶碳青霉烯酶基因的菌株共31株，檢出率為86.11%，其中檢出率最高的碳青霉烯酶基因為KPC，檢出率高達83.33%，這與王青等[16]的研究對應，這一結果提示bla-KPC基因或為CRE對碳青霉烯類抗生素具有耐藥性的最主要原因。值得關注的是，本研究耐藥性分析顯示對CRE敏感率最高的三種抗菌藥物為阿米卡星、慶大霉素、呋喃妥因，敏感率分別為69.88%、37.35%、37.35%，這也提示上述三種抗菌藥物或對CRE感染治療具有臨床價值。本研究通過對CRE菌種分布、碳青霉烯酶基因分布及耐藥性展開分析，可為臨床CRE檢出患者抗菌藥物種類的選擇及整體治療方案的制訂提供參考依據，具有一定現實意義。但是，本研究受人員、經費及研究時間等限制，存在樣本量小、實驗數據較單一等局限性，可能導致結果與臨床實際存在偏差，仍存在進一步拓展研究價值。

綜上所述，KPC基因是檢出率最高的碳青霉烯酶基因，而阿米卡星、慶大霉素、呋喃妥因對CRE敏感率分別達到69.88%、37.35%、37.35%，以上三種抗菌藥物對臨床CRE感染治療具有積極意義。此外，合理使用抗菌藥物，提高院感防控力度是降低CRE感染的有效手段。