視網(wǎng)膜母細胞瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因挖掘及驗證

黃子珊，符馨予，周希瑗

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科/眼科學(xué)重慶市市級重點實驗室，重慶 400010

視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma，R B)是嬰幼兒最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤[1]，年發(fā)病率為1/18 000～1/16 000，可分為遺傳型(約45%)和非遺傳型(約55%)[2]，如果不及時治療可能導(dǎo)致失明或死亡。為實現(xiàn)RB的早診斷、早治療及降低病死率，尋找RB的關(guān)鍵基因尤為重要。加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)分析目前已廣泛應(yīng)用于與腫瘤相關(guān)的高通量數(shù)據(jù)挖掘中[3-4]，該分析方法可尋找協(xié)同表達的基因模塊，探索基因模塊與關(guān)注的表型(如臨床數(shù)據(jù))之間的關(guān)系，構(gòu)建共表達網(wǎng)絡(luò)并尋找網(wǎng)絡(luò)中的核心基因，主要通過基因之間相關(guān)系數(shù)計算、基因模塊的確定、共表達網(wǎng)絡(luò)、模塊與性狀關(guān)聯(lián)4個步驟來尋找影響疾病的關(guān)鍵基因。本研究運用多種生物信息學(xué)分析方法尋找與RB發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵基因，并通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)及免疫組化等多種方法對篩選出來的關(guān)鍵基因進行驗證，以進一步尋找能夠用于早期診斷RB的生物標志物。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載及處理 從GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)基因表達數(shù)據(jù)庫中下載基因表達譜數(shù)據(jù)集GSE110811、GSE24673、GSE97508，3個芯片數(shù)據(jù)集共包含43例RB樣本和7例正常對照組織樣本。其中，GSE110811基于GPL16686平臺，包含28例RB和3例正常視網(wǎng)膜組織樣本(本研究排除了1例正常對照樣本GSM3017153，原因為該數(shù)據(jù)集樣本可能混有腫瘤組織[5])；GSE24673基于GPL6244平臺，包含9例RB和2例健康成人視網(wǎng)膜組織樣本；GSE97508基于GPL15207平臺，包含6例RB和3例正常視網(wǎng)膜組織樣本。

根據(jù)平臺注釋信息將陣列探針名轉(zhuǎn)換為匹配的基因名。采用perl軟件將這3個數(shù)據(jù)集合并，用R軟件的sva包消除3個數(shù)據(jù)集之間的批次效應(yīng)(樣品在不同時間、不同分組或由不同的人處理造成的差異)[6]。將3個數(shù)據(jù)集的矩陣數(shù)據(jù)合并為1個數(shù)據(jù)集，共包含43例RB和7例正常對照組織樣本。

1.2 篩選差異表達基因(differentially expressed gene，DEGs) 使用R語言的limma包分析合并數(shù)據(jù)集中RB與正常對照樣本之間的DEGs矩陣，篩選條件設(shè)置為|logFC|＞1，P＜0.05[7]。

1.3 GO(gene ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析 對DEGs進一步分析，利用R語言clusterProfiler[8]包進行GO富集分析和KEGG通路分析。校正后的P值(FDR)＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò) 將DEGs輸入STRING數(shù)據(jù)庫，以交互得分=0.9(最高置信度)作為閾值構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，然后導(dǎo)入Cytoscape(3.7.2版本)軟件中進行可視化分析和整理，運用cytoHubba插件以最大集團拓撲分析法(maximal clique centrality，MCC)[9]選取關(guān)鍵節(jié)點的基因[10]。

1.5 WGCNA分析 提取GSE110811腫瘤組28個樣本對應(yīng)的DEGs矩陣進行WGCNA分析，獲取該腫瘤樣本對應(yīng)的臨床信息。

1.5.1 共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與模塊劃分 利用R軟件的WGCNA包[11]，計算各基因間的Pearson相關(guān)系數(shù)，選擇適當?shù)能涢撝郸聵?gòu)建無尺度網(wǎng)絡(luò)；建立鄰接矩陣，轉(zhuǎn)換為TOM重疊矩陣；表達模式相似的基因分為一類，并構(gòu)成模塊；基于TOM矩陣，使用平均連鎖層次聚類方法來聚類基因，根據(jù)混合動態(tài)切割樹的標準設(shè)置最小模塊，構(gòu)建加權(quán)共表達網(wǎng)絡(luò)以篩選hub基因[12]，以0.5作為加權(quán)共表達相關(guān)系數(shù)的閾值，導(dǎo)入Cytoscape(3.7.2版本)中進行可視化分析，找到位于網(wǎng)絡(luò)中心的核心基因。

1.5.2 關(guān)鍵模塊篩選 將樣本的臨床信息與模塊基因進行關(guān)聯(lián)分析，尋找顯著相關(guān)的模塊。本研究患者臨床信息包括：有無遠處轉(zhuǎn)移、有無繼發(fā)性腫瘤、RB1基因突變、單雙側(cè)眼患病、診斷年齡和隨訪時間等。采用Pearson相關(guān)系數(shù)評估模塊與臨床信息之間的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)越大表示該模塊與臨床數(shù)據(jù)相關(guān)程度越高，該模塊即為關(guān)鍵模塊，并計算各個基因與臨床信息的相關(guān)系數(shù)。

1.5.3 關(guān)鍵模塊基因GO和KEGG分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵模塊的基因行GO富集分析和KEGG通路分析(P＜0.05為顯著性基因富集的篩選條件)。

1.6 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測關(guān)鍵基因的表達量

1.6.1 細胞培養(yǎng)及分組 人RB細胞株(Y79、WERIRB-1)分別購自上海佰曄生物科技中心和上海富衡生物科技公司；人視網(wǎng)膜色素上皮細胞株(ARPE-19)購自上海富衡公司。Y79及WERI-RB-1細胞培養(yǎng)基均利用RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)加20%胎牛血清(上海依科賽生物)及1.0%青鏈霉素溶液(上海碧云天公司)配制，ARPE-19細胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清(上海依科賽生物)及1.0%青鏈霉素溶液的DMEM-F12(美國Hyclone公司)培養(yǎng)基；所有細胞均在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Y79、WERI-RB-1細胞作為實驗組，ARPE-19細胞作為對照組。

1.6.2 qRT-PCR實驗步驟 收集細胞，PBS洗2或3次，加入Trizol裂解液(cat：15596026，美國Invitrogen公司)，依次使用氯仿、異丙醇和75%乙醇提取總RNA；利用超微量分光光度計對RNA樣品進行濃度和純度測定，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)并按照操作說明書配制反應(yīng)液，分兩步進行實驗將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；使用SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒(MCE公司)配制反應(yīng)體系，依次加入無酶水、SYBR Green染料、上下游引物、cDNA模板后混勻，用ABI 7500熒光定量PCR儀進行擴增反應(yīng)。設(shè)置熱循環(huán)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、60 ℃1 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 15 s，共40個循環(huán)[13]。以β-actin作為內(nèi)參照，5個關(guān)鍵基因引物序列見表1(由上海生工有限公司合成)。實驗重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR

1.7 免疫組化檢測關(guān)鍵蛋白表達量

1.7.1 臨床標本收集及分組 納入2016年1月－2019年1月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治的RB患者石蠟組織標本20例，所有患者術(shù)前均未進行放化療，獲取10例因車禍傷等原因進行眼球摘除患者的正常視網(wǎng)膜作為對照組。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會審批[(2019)270]。

1.7.2 免疫組化實驗步驟 石蠟切片常規(guī)脫蠟后，將組織切片置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)緩沖液(pH9.0)中進行抗原修復(fù)，放入3% H2O2溶液避光孵育25 min；滴加3%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30 min；分別加入著絲粒蛋白K(CENPK)抗體(北京博奧森公司)、兔抗人胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)控因子-1(PRC1)抗體(Abcam公司)4 ℃孵育過夜[14]，加入辣根過氧化酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗；用3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、蘇木精復(fù)染，脫水后中性樹脂封片，組織切片在顯微鏡下進行檢查。免疫組化的結(jié)果分級標準(0～12分)：0～4分為低表達組(陰性)，5～12分為高表達組(陽性)[15]。上述試劑除一抗外均購買自武漢賽維爾生物公司。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.3.0軟件進行qRT-PCR結(jié)果作圖及統(tǒng)計分析，多組間關(guān)鍵基因表達量的比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗；采用SPSS 25.0軟件對免疫組化結(jié)果進行分析，RB組織與對照組中關(guān)鍵蛋白的表達差異采用單側(cè)Fisher確切概率法進行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs的篩選 共得到1254個DEGs，其中表達上調(diào)基因422個，表達下調(diào)基因832個，具體分布情況見圖1。

圖1 視網(wǎng)膜母細胞瘤組織與正常組織差異表達基因的火山圖及熱圖Fig.1 Volcano and heat maps of differentially expressed genes in RB tissues and normal tissues

2.2 DEGs的功能注釋和通路富集 GO富集分析結(jié)果顯示，DEGs主要與蛋白質(zhì)異二聚體活性、陽離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、染色質(zhì)結(jié)合、無機陽離子跨膜轉(zhuǎn)運活性和細胞黏附分子結(jié)合等生物學(xué)功能密切相關(guān)(圖2A)。KEGG通路分析結(jié)果顯示，DEGs主要富集在細胞周期、光傳導(dǎo)、DNA復(fù)制和卵母細胞減數(shù)分裂等通路上(圖2B)。

圖2 視網(wǎng)膜母細胞瘤差異表達基因的GO富集分析(A)和KEGG通路分析(B)Fig.2 GO enrichment (A) and KEGG pathway analysis (B) of differentially expressed genes in RB

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選 PPI網(wǎng)絡(luò)由3567條邊、611個節(jié)點構(gòu)成，以MCC＞2.09×1013為標準得到79個基因[9]，即為網(wǎng)絡(luò)核心基因(圖3)。

圖3 視網(wǎng)膜母細胞瘤差異表達基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選Fig.3 PPI networks of DEGs and screening core genes in RB

2.4 WGCNA分析結(jié)果

2.4.1 共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與樞紐基因篩選 利用pickSoftThreshold函數(shù)篩選合適的軟閾值β，使無尺度拓撲擬合指數(shù)R2＞0.8以構(gòu)建共表達網(wǎng)絡(luò)(圖4A)，β=6時共表達網(wǎng)絡(luò)中基因之間的連接性滿足無標度網(wǎng)絡(luò)分布(圖4B)，利用MCC算法以得分＞4作為標準[9]，得到位于網(wǎng)絡(luò)中心的前13個基因，即為樞紐基因(圖4C)。

圖4 視網(wǎng)膜母細胞瘤WGCNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及其樞紐基因的篩選Fig.4 Screening of WGCNA network and key genes in RB

2.4.2 基因模塊的劃分與關(guān)鍵模塊篩選 利用動態(tài)混合剪切法獲得11個共表達基因模塊，其中灰色模塊是無法聚集到其他模塊的基因，基于模塊基因構(gòu)建模塊聚類樹(圖5A)，模塊的拓撲重疊熱圖反映模塊與模塊間基因的相關(guān)程度(圖5B)，基因的聚類樹狀圖展示模塊劃分過程(圖5C)。分別計算各個模塊與臨床性狀之間的Pearson相關(guān)系數(shù)及P值(圖6A)，以Pearson相關(guān)系數(shù)的絕對值＞0.55且P＜0.05作為篩選條件，篩選出5個重要模塊，分別是blue、pink、turquoise、red和brown模塊。Blue、pink和turquoise模塊與診斷年齡呈明顯正相關(guān)(r=0.65，P=2×10-4；r=0.58，P=0.001；r=0.59，P=0.001)，其中pink模塊還與單雙側(cè)眼患病和隨訪時間呈明顯負相關(guān)(r=-0.57，P=0.002；r=-0.63，P=4×10-4)；而red和brown模塊與繼發(fā)性腫瘤呈明顯正相關(guān)(r=0.57，P=0.001；r=0.55，P=0.002)。其中blue模塊與診斷年齡的相關(guān)系數(shù)最高，將blue模塊包含的基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖6B)。各個重要模塊包含的基因見表2。本研究還將基因與臨床性狀關(guān)聯(lián)，分別計算出每個基因與臨床性狀的相關(guān)性，選取與每項臨床性狀相關(guān)系數(shù)絕對值最高的基因，得到hmgb3、pcdhb3、ids、polh、birc5、guca1b共6個基因(表3)，其中pcdhb3與診斷年齡的相關(guān)系數(shù)最高(r=0.8411)。

圖5 視網(wǎng)膜母細胞瘤WGCNA分析模塊劃分過程Fig.5 WGCNA analysis module partition process in RB

表2 視網(wǎng)膜母細胞瘤研究中各個重要模塊包含的基因Tab.2 Genes contained in each important module of research on RB

表3 視網(wǎng)膜母細胞瘤與臨床性狀相關(guān)程度較高的基因列表Tab.3 The genes with the higher degree of correlation for each clinical trait in RB

2.4.3 GO富集分析和KEGG通路分析 Pink和red模塊包含基因數(shù)目較少，無法進一步進行富集分析，因此將blue、turquoise和brown模塊中的基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫中，以校正后的P值(FDR)＜0.05作為篩選條件。Blue模塊GO分析結(jié)果顯示，對于生物過程主要富集在細胞分裂、有絲核分裂等過程，對于細胞組分主要富集在細胞核、細胞質(zhì)、微管等結(jié)構(gòu)，對于分子功能主要富集在ATP結(jié)合、微管結(jié)合等功能方面；KEGG分析結(jié)果顯示主要富集在細胞周期、卵母細胞減數(shù)分裂等通路。Turquoise模塊基因主要與細胞核、核質(zhì)、ATP結(jié)合等相關(guān)，brown模塊基因主要富集在細胞核、核質(zhì)等細胞成分上。

2.5 關(guān)鍵基因篩選 將DEGs PPI的核心基因、WGCNA網(wǎng)絡(luò)的樞紐基因及重要模塊包含基因取交集(圖6C)，得到染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4(structural maintenance of chromosome 4，smc4)、微小染色體維持蛋白6(minichromosome maintenance complex component 6，mcm6)、著絲粒蛋白K(centromere protein K，cenpk)、驅(qū)動蛋白家族成員15(kinesin family member 15，kif15)、胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)控因子-1(protein regulator of cytokinesis 1，prc1)等5個關(guān)鍵基因。上述5個關(guān)鍵基因在RB中均為高表達基因，其logFC均＞1，關(guān)鍵基因所屬模塊及差異表達信息見表4。

圖6 模塊與臨床性狀相關(guān)性熱圖及blue模塊PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Heat map of correlation between module and clinical traits and PPI network of blue module

表4 視網(wǎng)膜母細胞瘤關(guān)鍵基因所屬模塊及差異表達信息Tab.4 The modules and differential expression information of key genes in RB

2.6 關(guān)鍵基因在細胞株中的表達情況 采用qRTPCR檢測5個關(guān)鍵基因的相對表達量，結(jié)果顯示，prc1和cenpk的相對表達量在Y79、WERI-RB-1細胞中明顯高于對照組(P＜0.05，圖7)。

圖7 視網(wǎng)膜母細胞瘤關(guān)鍵基因的相對表達量Fig.7 Relative expression levels of key genes in RB

2.7 RB及正常視網(wǎng)膜組織中PRC1、CENPK蛋白的表達情況 免疫組化結(jié)果表明，20例RB中有10例(50%)PRC1蛋白表達陽性，而10例正常視網(wǎng)膜中僅有1例(10%)呈陽性，故RB組織中PRC1蛋白陽性率高于正常視網(wǎng)膜，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。CENPK蛋白在RB和正常視網(wǎng)膜中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，圖8)。

圖8 PRC1及CENPK蛋白在視網(wǎng)膜母細胞瘤組織及正常視網(wǎng)膜中的表達(免疫組化染色, ×200)Fig.8 Expression of PRC1 and CENPK protein in RB tissue and normal retina (Immunohistochemical staining, ×200)

3 討 論

RB發(fā)生率居小兒惡性腫瘤的第2位[1]，嚴重威脅患兒生命。RB發(fā)病多在5歲以下，約2/3的患兒在3歲前患病，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢，且如果治療不及時，可能導(dǎo)致失明或死亡。因此，為實現(xiàn)RB的早診斷、早治療，尋找其關(guān)鍵基因及生物標志物顯得越來越重要。

目前，高通量數(shù)據(jù)資源越來越豐富，許多學(xué)者運用多種生物信息學(xué)方法進行大樣本數(shù)據(jù)挖掘[16]，尋找導(dǎo)致某種疾病發(fā)生的關(guān)鍵基因，以進一步發(fā)現(xiàn)與疾病診斷及預(yù)后相關(guān)的生物標志物，此方式較傳統(tǒng)研究方法更省時省力、節(jié)約經(jīng)費且科學(xué)有效。然而，以往的生物信息學(xué)分析多使用單個數(shù)據(jù)集[17]和單一方法分析DEGs[18]，而RB發(fā)病率較低且組織樣本獲取難度大，故組織樣本較為稀缺，單個數(shù)據(jù)集樣本量較少，可能導(dǎo)致分析結(jié)果不準確。因此，本研究將3個RB數(shù)據(jù)集中的原始數(shù)據(jù)進行合并以增加樣本量，運用差異表達分析聯(lián)合加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析，將DEGs劃分成不同模塊并與臨床性狀相關(guān)聯(lián)，篩選出了與RB發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的5個可能基因。其中，SMC4對哺乳動物的DNA修復(fù)至關(guān)重要，可能參與了基因表達沉默狀態(tài)的維持和DNA修復(fù)等過程，與肺腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及結(jié)直腸腫瘤發(fā)生相關(guān)，且與乳腺癌預(yù)后相關(guān)[19-22]。MCM6是高度保守的微型染色體維持蛋白之一，是啟動真核基因組復(fù)制所必需的，Liu等[23]發(fā)現(xiàn)其可促進肝細胞癌轉(zhuǎn)移，且可作為肝細胞癌早期復(fù)發(fā)的一種新的血清生物標志物[24]。CENPK與著絲粒功能和有絲分裂進程密切相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，它可能參與了肝細胞癌的惡性化進展[25]。Lee等[26]發(fā)現(xiàn)，CENPK在卵巢癌細胞中表達上調(diào)且可作為卵巢癌的一種新的腫瘤標志物。KIF15可促進黑色素瘤生成[27]，也是促進胰腺癌增殖的重要調(diào)控因子[28]。PRC1基因位于15q26.1，與細胞增殖、胞質(zhì)分裂、紡錘體及微管的形成密切相關(guān)。

本研究的生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，這5個基因均為RB組織中表達上調(diào)的基因。WGCNA分析結(jié)果顯示它們均為重要模塊中的基因，其中smc4屬于blue模塊，mcm6、prc1屬于brown模塊，cenpk、kif15則是turquoise模塊的組成部分。由于blue模塊與診斷年齡呈明顯正相關(guān)，brown及turquoise模塊與繼發(fā)性腫瘤呈明顯正相關(guān)，因此，smc4可能與RB的發(fā)病進程相關(guān)，而mcm6、prc1、cenpk、kif15可能與RB繼發(fā)性腫瘤的發(fā)生存在一定相關(guān)性。但由于目前這些基因在RB中的研究較少，其在RB中的功能仍需進一步探索。另外，通過對上述關(guān)鍵模塊基因的GO及KEGG分析發(fā)現(xiàn)，此類基因主要參與細胞核、微管等結(jié)構(gòu)形成，與細胞周期及有絲分裂過程等通路密切相關(guān)，因此，推測這些關(guān)鍵模塊中的差異表達基因可能是通過調(diào)控細胞生物學(xué)過程及信號通路來影響RB的發(fā)病進程的。此外，本研究還將基因與臨床性狀關(guān)聯(lián)，分別計算出每個基因與臨床性狀的相關(guān)性，選取與每項臨床性狀相關(guān)系數(shù)絕對值最高的基因，得到了pcdhb3等共6個基因，其中pcdhb3與臨床性狀(診斷年齡)的相關(guān)系數(shù)最高。有研究發(fā)現(xiàn)，PCDHB3是一種新型的結(jié)直腸癌腫瘤抑制因子，且可能是晚期結(jié)直腸癌的預(yù)后標志物[29]，因此，此類基因在RB中的功能也值得進一步研究。

為驗證上述篩選出的關(guān)鍵基因是否在RB細胞株中高表達，本研究體外培養(yǎng)了Y79、WERI-RB-1及ARPE-19細胞進行qRT-PCR實驗，結(jié)果表明prc1及cenpk這兩個基因在RB細胞中高表達(P＜0.05)。此外，通過前面的生物信息學(xué)分析可以發(fā)現(xiàn)，在這5個基因中cenpk、prc1在RB中的表達明顯上調(diào)，而且它們在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。結(jié)合qRT-PCR實驗結(jié)果，我們挑選cenpk、prc1這兩個基因進行進一步實驗，即在RB組織樣本中利用免疫組化實驗在蛋白質(zhì)水平進行驗證，結(jié)果表明PRC1蛋白在RB組織中的表達量明顯增高(P＜0.05)。PRC1在惡性腫瘤中的作用研究尚少，Wang等[30]發(fā)現(xiàn)，PRC1高表達在肝癌細胞中增加了癌細胞的化療耐藥性。Liao等[31]對2株RB細胞(HXO-RB44和WERI-Rb-1)進行siRNA轉(zhuǎn)染使prc1表達量降低后，發(fā)現(xiàn)RB細胞的增殖和血管生成受到了抑制，該過程是通過抑制Wnt/β-catenin通路實現(xiàn)的，表明PRC1蛋白對RB的發(fā)生具有重要影響。

綜上所述，本研究運用差異表達分析聯(lián)合加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析提取出了與RB相關(guān)的關(guān)鍵基因，其中RB細胞及組織中的PRC1表達量明顯高于對照組，且Liao等[31]的體外實驗表明沉默prc1基因可抑制RB細胞的增殖和血管生成，這些結(jié)果均提示PRC1可能對RB的發(fā)生發(fā)展具有一定的促進作用。此外，本研究對探究RB的發(fā)病機制及潛在的治療靶點提供了新視角，但還需進行進一步體內(nèi)實驗來驗證這些關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能。