DcR3表達(dá)在肝癌細(xì)胞凋亡和增殖中的作用研究

董 靜 陳 萍 呂艷欣 李鵬輝 王 玉

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 黑龍江 齊齊哈爾 161000)

肝癌是一種發(fā)生于肝臟的癌癥，早期肝癌通常沒有任何癥狀，隨著疾病進(jìn)展，患者可能出現(xiàn)不明原因的體重減輕、食欲不振、少量進(jìn)食就感覺很飽、反復(fù)有惡心或嘔吐等癥狀。肝癌細(xì)胞發(fā)生的分子機(jī)制方面，一般包括了癌基因還有抑癌基因的突變，除了這兩個(gè)之外，也有生長因子在失控方面的表達(dá)等[1]。DcR3屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)的一個(gè)成員，這個(gè)指標(biāo)可以采用競爭的方法對相關(guān)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和通路起到阻斷的作用，可以對細(xì)胞的增殖情況起到調(diào)節(jié)的作用，控制住細(xì)胞的凋亡。基于此，本文通過探究DcR3表達(dá)在肝癌細(xì)胞凋亡和增殖中的作用，為肝癌細(xì)胞分子治療與預(yù)后提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人肝癌細(xì)胞株HepG2、MHCC-LM3、MHCC-97H這些都是從北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司提供的，然后DMEM培養(yǎng)液還有胰蛋白酶等是由美國Hyclone公司提供的；上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供的有LV-DcR3、LV-NC這兩個(gè)物質(zhì)；美國Abcam公司則是生產(chǎn)了鼠抗DcR3單克隆抗體，武漢艾美捷科技有限公司是生產(chǎn)了鼠抗CADPH單克隆抗體；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR由日本Takara公司提供。

1.2 方法

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：肝癌的細(xì)胞株里面HepG2、MHCC-LM3、MHCC-97H都是使用了10%濃度的胎牛血清，并對青鏈霉素DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，劑量都是100U/mL，在37℃的溫度下、5%的CO2培養(yǎng)箱里面進(jìn)行常規(guī)的培養(yǎng)；取對數(shù)期的細(xì)胞，一般情況下每個(gè)孔都是3×105個(gè)細(xì)胞接種，大概是6個(gè)孔板；在細(xì)胞的密度在80%以上的時(shí)候再進(jìn)行LV-DcR3、LV-NC；在感染之前把培養(yǎng)基扔掉，使用新的，然后根據(jù)相關(guān)病毒滴度測定的結(jié)果加入病毒的上清，大概是MIO 50TU/mL，同樣在37℃的溫度下、5%的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，然后在12小時(shí)之后更換培養(yǎng)基，72小時(shí)之后觀察感染的情況。之后再對相關(guān)細(xì)胞進(jìn)行收集并檢測蛋白免疫的印記還有細(xì)胞生長的曲線。(2)對DcR3蛋白進(jìn)行檢測：使用細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂解，并使用BCA的蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量之后，把上樣緩沖液加進(jìn)去攪拌均勻之后，在100℃的情況下進(jìn)行變性，大概10分鐘，然后進(jìn)行10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后開始濕轉(zhuǎn)，大概10分鐘，結(jié)束之后把其轉(zhuǎn)移到PVDF膜的位置上，再使用脫脂奶粉封閉液進(jìn)行封閉，濃度大概是5%，時(shí)間是2小時(shí)；一抗按照比例加入，在4℃的溫度下孵育一夜，使用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行3次漂洗，每次都是10分鐘；然后再進(jìn)行二抗，需要在室內(nèi)正常的溫度下進(jìn)行孵育，時(shí)間大概是1小時(shí)，然后再進(jìn)行漂洗，也是需要3次，每次的時(shí)間減少到5分鐘，最后觀察檢測出來的結(jié)果。(3)對mRNA表達(dá)的水平進(jìn)行檢測：需要先把細(xì)胞里面的RNA提取出來，使用的方法是Trizol，然后再把總RNA的1μg mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用的試劑盒是逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，轉(zhuǎn)錄的時(shí)候需要在42℃的條件下進(jìn)行，時(shí)間大概是60分鐘，然后在70℃的溫度下重復(fù)一次，時(shí)間是5分鐘。qPCR：PCR反應(yīng)體系為20μL是這個(gè)PCR反應(yīng)的一個(gè)體系，一般情況下每個(gè)孔都需要3個(gè)復(fù)空，然后進(jìn)行預(yù)變性，溫度是95℃，大概需要2分鐘，然后在95℃條件下預(yù)變性15秒、60℃的條件下預(yù)變性34秒，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.3 觀察指標(biāo)

2 結(jié)果

2.1 不同肝癌細(xì)胞株DcR3蛋白、mRNA表達(dá)

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞株的DcR3蛋白表達(dá)水平要低于MHCC-LM3、MHCC-97H，P<0.05；HepG2在mRNA表達(dá)水平中明顯低于MHCC-LM3、MHCC-97H，P<0.05，如下表。

表1 不同肝癌細(xì)胞株DcR3蛋白、mRNA表達(dá)

2.2 上調(diào)DcR3表達(dá)后凋亡指標(biāo)轉(zhuǎn)錄水平

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，LV-DcR3組caspase-3、Bax低于LV-NC組，Bcl-2則高于LV-NC組，P<0.05，如下表。

表2 上調(diào)DcR3表達(dá)后凋亡指標(biāo)轉(zhuǎn)錄水平

3 討論

在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展里面，DcR3這個(gè)指標(biāo)有著比較重要的作用，而且這個(gè)基因也是屬于TNFR超家族的一個(gè)成員，也就是說該指標(biāo)和TNFR有著較高的同源性，可以通過一些介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，還有蛋白分子的胚體進(jìn)行結(jié)合，這樣可以對后者物質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起到阻斷的作用[2]。其次，這個(gè)基因可以對T細(xì)胞進(jìn)行阻斷，也可以對腫瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)行阻斷，阻斷的方式各式各樣，所以這個(gè)基因在很多種惡性的腫瘤發(fā)生和發(fā)展方面有著比較重要的作用。

本次研究里面對DcR3的慢病毒進(jìn)行建立，并對其表達(dá)的水平進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染成比較低的HepG2細(xì)胞，然后再驗(yàn)證轉(zhuǎn)染的效率。不過在對這個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行上調(diào)之后可以看出，能夠進(jìn)一步促進(jìn)HepG2這個(gè)細(xì)胞株在增殖還有抗凋亡方面的能力[3]。Caspase-3在細(xì)胞凋亡中起到了重要作用，因?yàn)榛罨腃aspase-3是可以引起細(xì)胞凋亡，但是這個(gè)過程也是可以被Bcl-2進(jìn)行阻斷[4]。在本次的研究中發(fā)現(xiàn)，LV-DcR3組caspase-3低于LV-NC組，可以表明這個(gè)基因在肝癌細(xì)胞進(jìn)行凋亡的時(shí)間段里面起到了比較重要的作用。本次研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，在對這個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行下調(diào)的時(shí)候，可以看出肝癌細(xì)胞里面HepG2這個(gè)細(xì)胞的增殖能力發(fā)生了比較明顯的下降，也就是說這個(gè)指標(biāo)在一定程度上是可以對相關(guān)細(xì)胞的增殖進(jìn)行控制的。但由于相關(guān)研究較少，需進(jìn)一步研究其是如何進(jìn)行調(diào)控，只有這樣才可以在-為這個(gè)疾病的患者進(jìn)行治療的時(shí)候提供比較科學(xué)的基礎(chǔ)。

綜上所述，在肝癌細(xì)胞進(jìn)行增殖還有抗凋亡方面，DcR3這個(gè)基因都是有著比較重要的作用，因?yàn)槠浜蜕险{(diào)抗癌基因的表達(dá)方面有著比較密切的關(guān)系。