過表達5-脂氧合酶通路對氧糖剝奪/復氧小膠質細胞增殖、凋亡的影響

周 爽,王 琰,孫光強,史永恒,王 川,王國全,李 敏,王 斌

(陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046)

缺血性腦卒中嚴重危害人類健康，目前使用纖栓劑溶栓是臨床首選治療手段，但重建血流導致再灌注腦損傷，即腦缺血/再灌注損傷(Cerebral ischemic/reperfusion injury,CI/RI)，神經保護治療則成為應用前景。CI-RI是多種機制參與的一種復雜病理生理過程，研究表明，當腦缺血再灌注發生時，在缺血灶局部存在大量炎癥因子，炎癥反應是引起腦缺血損傷后再灌注損傷的關鍵原因之一[1]。因此，通過改善炎癥損傷來減輕腦缺血損傷，并可調節炎性因子失衡[2]，研究引起損傷的炎癥反應無論是對缺血性腦卒中還是對之后的CI/RI都有著重要意義。腦缺血損傷發生后花生四烯酸含量增加，5-脂氧合酶(5-Lipoxygenase，5-LOX)作用花生四烯酸代謝衍生白三烯和生物活性物質的產生，這類活性物質將參與中風后的病理生理過程，例如氧化應激和炎癥，還可能促成細胞凋亡[3-4]。5-LOX與炎癥性中樞神經系統疾病有關，5-LOX的過表達可能促進炎癥細胞因子的產生并導致CI/RI后神經元損傷更為嚴重[5]。

小膠質細胞(Microglia,MG)是腦內的固有免疫細胞，在CI/RI發生后的炎癥反應中起重要作用[6]。在腦缺血損傷后期，由于MG被過度激活，激活后的MG表達產生趨化因子和炎性因子，炎性因子聚集在腦缺血損傷部位，進一步加劇腦損傷[7]。隨著MG在中樞神經系統中的日益關注，5-LOX通路也被認為參與了中樞神經系統的炎癥反應[8-9]，MG中5-LOX通路的下調有助于缺血性腦損傷的恢復，但研究5-LOX，其最大的特點是能夠在體內外轉染分裂和非分裂的細胞，是一種具有自我失活功能、無免疫反應的高效基因傳遞工具。并且具有容納外源目的基因，可將所攜帶的目的基因整合到宿主染色體中并穩定長期表達、隨親本的繁殖將外源基因傳遞給子代發揮作用等優點[10]。為根據慢病毒載體技術的進展，提高效率和生物安全性的載體設計，進一步研究5-LOX途徑在CI/RI中作用機制。通過建立5-LOX過表達氧糖剝奪/復氧(OGD/R)BV2細胞模型，研究5-LOX在腦缺血炎性損傷中神經保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細胞與質粒來源：BV2小鼠MG系購自CTCC。pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro質粒和293T細胞購自天津賽爾生物技術有限公司。脂質體Lipofectamine2000 Reagent購自Invitrogen(美國)。

1.1.2 主要試劑與儀器:LB培養基(Sigma，美國)，B型質粒小量快速提取試劑盒(博大泰克，北京)，XL1-Blue，EB(Ethidium Bromide北京鼎國，北京)，限制型內切酶EcoRI，BamHI和dNTP (10 mmol/L)(Takara，日本)，T4 DNA ligase(Promega，美國)，無血清培養基Opti-MEM(Invitrogen,美國)。L420型臺式離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，PTC-200型熱循環儀(Bio-Rad,美國)，CO2恒溫培養箱(Thermo Forma,美國)，5415D型離心機(Eppendorf,德國)，DK-8B型電熱恒溫水槽購自(上海精宏實驗設備有限公司)，倒置顯微鏡和96孔培養板(OLYMPUS,日本)。

1.2 研究方法

1.2.1 BV2細胞培養：BV2細胞是小鼠小膠質細胞株，使用DMEM完全培養基(含有10%胎牛血清，100 U/ml青霉素與100 μg/ml鏈霉素)在二氧化碳培養箱(5%CO2，37 ℃條件)中培養、傳代。

1.2.2 BV2細胞感染過表達5-LOX病毒/對照病毒： pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro質粒載體(圖1)。將Alox5序列信息序列直接合成至pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro載體上。復蘇并培養的293T細胞，給予DMEM完全培養基。在37 ℃、5%CO2的培養箱中培養293T細胞，培養過程中，每24 h換液，傳代比例為1∶5～1∶10。將pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro質粒載體轉染293T細胞進行慢病毒包裝，收集上清液，濃縮制成病毒顆粒，同樣方法構建空載體病毒。病毒顆粒感染BV2小膠質細胞，G418進行細胞致死率篩選，挑選穩定轉染的單克隆抗體細胞株。我們將G418藥物設置4個濃度梯度來細胞致死率的濃度篩選，濃度設置分別為200、300、400 μg/ml、500 μg/ml。細胞大量死亡出現在第3天到第8天中，除去死亡細胞，收集活下來的細胞形成單克隆，并將感染后的細胞轉至96孔板，繼續培養。

圖1 pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro/Alox5質粒

1.2.3 建立OGD/R 5-LOX過表達BV2細胞模型:5-LOX過表達的BV2細胞在完全培養基中培養，收集第三代細胞，胰蛋白酶將BV2細胞從培養瓶中消化下來，BV2細胞制成懸液。調整細胞密度，將細胞再次接種于細胞培養板中，細胞中的完全培養液更換為無糖Earle’s液，利用三氣培養箱37 ℃下(94%氮氣、5%二氧化碳、1%氧氣)建立缺氧缺糖模型。在氧糖剝奪實驗中，BV2細胞分為5-LOX病毒過表達組與CON空病毒載體組，氧糖剝奪分別0、1、2、4 h，復氧12 h，根據顯微鏡下拍攝OGD處理0、1、2、4 h的細胞形態，確立OGD/R 5-LOX過表達BV2細胞模型。

1.2.4 細胞給藥及分組:BV2細胞5-LOX過表達組與空載體對照組給予齊留通(Zileuton)、孟魯司特(Montelukast)、U75302被用來分別阻斷5-LOX，CysLTR1和BLT1通路。將細胞分為以下10組，正常組按照常規細胞培養方法，給予完全培養液，并不進行OGD/R的處理。5-LOX過表達組給予5-LOX過表達病毒轉染；除空白組外其他組均進行缺糖缺氧/復氧處理，給藥組分別給予Zileuton、Montelukast、U75302處理。見表1。

表1 實驗分組與給藥

1.2.5 MTT檢測OGD/R5-LOX過表達BV2細胞的細胞活性：按照實驗分組將細胞接種與96孔板上，除空白組外，均進行OGD/R處理細胞，進行細胞活性檢驗，除設空白孔外，空載體與5-LOX過表達10個分組，分別各設置3個復孔，分別向每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，放置于(37 ℃，5%CO2)培養箱繼續培養4 h，棄去培養液，PBS沖洗，每孔加入150 μl DMSO溶解沉淀。酶標儀將波長設置為570 nm，測出各孔的吸光度值。抑制率=[(對照組-實驗組)/對照組]×100%。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡：將空載體與5-LOX過表達10個分組的各組細胞用0.25%的胰蛋白酶消化，加入10 μl碘化丙啶(PI)染色液混勻，室溫避光20 min，將避光后的細胞置于冰水混合物中，使用流式細胞儀進行檢測。PI熒光信號值用縱坐標表示，Annexin-V-FITC熒光信號值表示為橫坐標。碘化丙啶染色對正常細胞是無法染色的，LR區域屬于細胞膜完整，PI染色。UR區域中的細胞膜破裂，PI和Annexin-V-FITC均可染色。

2 結 果

2.1 全基因合成pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro/Alox5質粒測序結果比對 結果顯示(圖2)，Alox5測序結果比對結果顯示，pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro/Alox5質粒全基因合成成功。

圖2 pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro/Alox5質粒

2.2 5-LOX過表達轉染后對BV2細胞形態的影響 細胞形態結果見圖3。與空載體對照組氧糖剝奪0 h對比，空載體對照組氧糖剝奪1、2、4 h后細胞數目逐漸減少，細胞形態改變，空白組細胞形態完整，呈現梭形。空載體對照組OGD后細胞逐漸形成“阿米巴狀”，5-LOX過表達則增加細胞損傷，給藥組分別能減緩細胞的“阿米巴狀”。根據前期實驗，氧糖剝奪復氧時間，由細胞生長狀態改變，我們選取缺氧4 h復氧12 h為腦缺血體外模型。

圖3 缺氧不同時間各組細胞形態(PI染色，×200)

2.3 OGD/R 5-LOX過表達對BV2細胞增殖影響 缺氧2 h復氧12 h處理條件下,檢測5-LOX過表達的小膠質細胞活力，實驗分組同1.2.4。第1組和第6組是未經過OGD/R處理的空白對照組，第2組是空載體OGD/R模型組，第7組是5-LOX過表達OGD/R模型組。空載體對照病毒OGD/R組與空白組相比活力降低，空載體對照組給予Zileuton(第3組)、Montelukast(第4組)、U75302(第5組)后，與OGD/R空載體對照組對比，給通路阻斷劑后，細胞活力較對照組有一定提高，且U75302活性優于Montelukast。病毒空載體模型組(第2組)與5-LOX過表達病毒模型組(第7組)對比，5-LOX過表達后細胞活力下降，同樣給予Zileuton、Montelukast、U75302組的細胞活性比5-LOX病毒過表達OGD/R模型組(第7組)高，5-LOX過表達Zileuton(第8組)與Montelukas(第9組)對細胞的保護作用基本接近，U75302(第10組)高于Zileuton(第8組)與Montelukas(第9組)。

2.4 OGD/R 5-LOX過表達對BV2細胞凋亡的影響 實驗分組同1.2.4。流式細胞儀檢測結果顯示，在空載體對照病毒中，空白組(第1組)與模型組OGD/R(第2組)對比，OGD/R后細胞的凋亡明顯升高，給予Zileuton(第3組)、Monteluka、U75302(第5組)能夠減弱凋亡，空載體病毒Zileuton(第3組)明顯降低細胞凋亡，接近空白(第1組)，Montelukas(第4組)與U75302(第5組)降低細胞凋亡與模型組OGD/R對比差異有統計學意義(均P<0.05)。5-LOX過表達與空病毒空白組對比后，過表達的5-Lox病毒對細胞凋亡增加較小。模型組與空白組對比均具有統計學差異(P<0.01)，給藥組與模型組對比均具有統計學差異(P<0.01)。

空病毒對照組中，UR和UL區域細胞染色都是0%，在LL區域99%，細胞膜完整，LR區域0.86%，表示僅有極少凋亡細胞；空病毒組OGD/R后，細胞分別在UR區域0.221%，UL區域0.412%，細胞膜破裂，膜內磷脂酰絲氨酸被染色；在空病毒Zileuton組，細胞集中LL區域，UL與UR區域0%，僅有LR區域1.44%的凋亡細胞；空病毒Montelukast組中UL與UR區域0%，LR區域凋亡細胞2.73%；空病毒U75302組中，UL區域0.021%，UR區域0.126%，LR區域2.56%，與Montelukast、Zileuton組對比，U75302組中細胞死亡和細胞壁破裂較多。5-LOX病毒過表達對照組中，UR區域0%，LR區域0.087%，在LL區域90.6%的細胞膜完整，LR區域9.32%，與空載體對照組相比，5-LOX過表達后，細胞膜破裂出現，細胞出現死亡和晚期凋亡；空病毒組OGD/R后，細胞分別在UR區域1.48%，LR區域10.9%，細胞凋亡與死亡進一步增加；5-Lox過表達Zileuton組，細胞4個區域具有分布，UL:0.153%，UR:0.123%，LR:2.56%，細胞凋亡得到改善；5-LOX過表達U75302組中，UL:0.021%，UR:0.126%，LR:2.56%，與Zileuton組對比，U75302組中UR和UL區域細胞染色都是0%，在LL:97.1%，LR:2.87%，表示僅有極少凋亡，細胞死亡和細胞壁破裂減少。

3 討 論

CI/RI后引起繼發性損傷，炎性反應的發生不但與MG等中樞神經系統免疫細胞活化有關[11]，損傷發生后小膠質細胞迅速活化，變成具有吞噬能力的“阿米巴狀”，同時釋放大量細胞因子和炎癥介質，會引起繼發性腦損傷。5-LOX屬于一類稱為脂氧合酶的酶，可氧化游離和酯化的多不飽和脂肪酸。5-LOX作用花生四烯酸代謝衍生白三烯，生成白三烯A4(LTA4)，LTA4通過其酶促反應轉化為白三烯B4(LTB4)和白三烯C4(LTC4)[12-13]。LTB4受體可分為BLT1和BLT2，LTC4可生成半胱氨酸白三烯受體CysLT1和CysLT2，它們可以識別白三烯LTD4、LTD4、LTE4和LTF4。實驗結果得出5-LOX過表達增加細胞損傷。以5-LOX過表達病毒轉染BV2細胞的手段，通過顯微鏡拍照觀察，在不同缺糖缺氧時間中，細胞形態損傷變化情況。并根據細胞形態，篩選缺糖缺氧復氧模型的時間。BV2細胞采用OGD/R模型，模擬腦缺血再灌注損傷。基于前期對BV2的缺氧實驗研究發現，在腦缺血損傷后，BV2被激活，細胞炎性因子增加。本次實驗發現缺氧超過4 h就會對BV2的生長造成一定影響，缺氧1 h對細胞影響不大，但也不能很好的造成氧糖損傷模型，缺氧6 h后，細胞呈現“阿米巴狀”較多，且BV2細胞的數量減少，細胞存活率下降。實驗組最終確立模型時間為缺氧缺糖4 h，復氧12 h模型。

Zileuton作為5-LOX的抑制劑，它可有效地衰減在PC12細胞中的MG介導的魚藤酮毒性[14]。在實驗研究中，5-LOX上調在低氧血癥患者的大腦皮層中，5-LOX在MG表達中升高[15]。這些結果表明5-LOX途徑與MG炎癥引起的神經元死亡有關。LTB4和CysLT1和CysLT2是主要的促炎介質，5-LOX途徑在許多疾病中均被激活引起炎癥反應[16]。研究發現CysLTs在各種神經調節過程具有重要調節作用，CysLTs及其受體與多種神經退行性疾病相關，例如多發性硬化癥，帕金森氏病，亨廷頓氏病，癲癇和阿爾茨海默氏病[17]。抗白三烯藥物分為兩類：CysLT受體拮抗劑(扎魯司特，普侖司特和孟魯司特Montelukast)和LTs抑制劑(5-脂氧合酶抑制劑，例如齊留通Zileuton，ZD2138，BayX1005和MK-0591)。白三烯B4(LTB4)參與多種疾病中發生的炎癥，U75302是BLT1受體拮抗劑，LTA4水解酶是LTB4生產中的限速酶，拮抗劑的使用均可以降低炎性反應[18-19]。選擇性5-LOX抑制劑Zileuton和CysLTR1拮抗劑Montelukast可減輕膠質細胞的炎性損傷提高細胞活力[20]。U75302是LTB4的受體阻斷劑，使用U75302阻斷LTB4/BLT1信號通路已被用于緩解各種炎癥和線粒體功能障礙[21]。Montelukast是白三烯的受體抑制劑，它可以降低LPS刺激的人類嗜中性粒細胞活化，同時減輕急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)小鼠模型的炎癥[22]。

綜上所述，通過探索5-LOX通路在氧糖剝奪/復氧小膠質細胞，我們發現過表達的5-LOX可以介導小膠質細胞OGD/R的損傷和激活。在OGD/R誘導的腦缺血損傷中，5-LOX激活是通過5-LOX過表達介導的BV2細胞中CysLTRs/CysLTs和LTB4/BLTs途徑的氧化應激介導的，這一結果能夠為腦缺血/再灌注損傷的診斷和臨床治療提供分子基礎[23]。