LncRNA DLX6-AS1靶向miR-103a-3p調控H2O2誘導的心肌細胞損傷

黃明月 曹旭東 趙春輝

急性心肌梗死(AMI)是一種致殘、致死率較高的心血管疾病，近年其發病率逐年上升，并呈年輕化趨勢，已成為一種突出的公共衛生問題。心肌缺血/再灌注(I/R)損傷是限制AMI治療成功的關鍵，研究顯示在再灌注期活性氧的過量產生可觸發急性炎性反應，誘導細胞凋亡，加劇心臟損傷[1]。因此，減少心肌細胞氧化應激、凋亡和炎性反應在臨床AMI治療中具有重要意義。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是包含大于200個核苷酸的轉錄產物，其通過作為miRNA分子誘餌，上調蛋白編碼基因表達，參與包括心肌I/R損傷等多種心肌血管疾病進展。先前研究表明，生長阻滯特異性轉錄本5(GAS5)、牛磺酸上調基因1(TUG1)等多種LncRNA均通過調控miRNA表達加劇心肌I/R損傷[2,3]。LncRNA DLX6-AS1已被證實在結腸癌、喉鱗癌等多種癌癥中表達上調并促進癌癥惡性轉化[4,5]，然而LncRNA DLX6-AS1在心肌I/R損傷中的作用目前并不清楚。Starbase預測到miR-103a-3p是LncRNA DLX6-AS1的潛在靶點。miR-103a-3p已被證實在缺氧復氧誘導的心肌細胞中表達下調，miR-103a-3p表達恢復可減弱心肌細胞自噬和凋亡[6]。因此，LncRNA DLX6-AS1是否靶向miR-103a-3p參與心肌I/R損傷值得探討。本研究以H2O2誘導的心肌細胞模擬體外心肌I/R損傷過程，旨在明確LncRNA DLX6-AS1靶向miR-103a-3p對H2O2誘導的細胞凋亡、氧化損傷和炎性反應的影響，以期為心肌I/R損傷的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 大鼠心肌細胞H9C2購于中國典型培養物保藏中心；SYBR Green Real-time PCR Master Mix購于北京索萊生物科技公司；cDNA第一鏈合成試劑盒、Trizol試劑、Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司；LncRNA DLX6-AS1的小干擾RNA(si-LncRNA DLX6-AS1)及其陰性對照(si-NC)、miR-103a-3p模擬物(mimics)及其陰性對照(miR-NC)、miR-103a-3p抑制物(anti-miR-103a-3p)及其陰性對照(anti-miR-NC)、LncRNA DLX6-AS1過表達質粒(pcDNA-LncRNA DLX6-AS1)及其陰性對照(pcDNA-NC)、熒光素酶報告載體購于上海吉瑪制藥公司；丙二醛(MDA)含量測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、乳酸鹽脫氫酶(LDH)活性檢測試劑盒購自南京建成生物研究所；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin-V-FITC)凋亡檢測試劑盒、雙熒光素酶活性測定試劑盒購于北京百奧萊博生物公司；大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)和IL-6酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購于上海逸風生物科技公司；兔源裂解的半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase-3)抗體、羊抗兔IgG二抗購于上海艾博抗生物公司。

1.2 H9C2細胞培養、轉染與分組 H9C2細胞在含有1%青霉素/鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM溶液中培養，培養箱環境為37℃、CO2體積分數為5%，胰酶消化80%匯合細胞，按照1∶4比例傳代。以第3代對數期細胞進行實驗。參照閆振富[7]的實驗方法用含200 μmol/L H2O2的培養液孵育H9C2細胞48 h模擬體外心肌I/R損傷過程，記為H2O2組；正常培養的H9C2細胞記為正常對照(NC)組。將對數期H9C2細胞以每孔2×105個細胞的密度接種6孔板，待細胞60%匯合時參照Lipofectamine 2000使用說明書進行瞬時轉染，收集轉染48 h細胞。用含200 μmol/L H2O2的培養液孵育轉染si-NC、si-LncRNA DLX6-AS1、miR-NC、miR-103a-3p mimics、anti-miR-NC與si-LncRNA DLX6-AS1、anti-miR-103a-3p與si-LncRNA DLX6-AS1的H9C2細胞48 h，記為H2O2+si-NC組、H2O2+si-LncRNA DLX6-AS1組、H2O2+ miR-NC組、H2O2+miR-103a-3p組、H2O2+si-LncRNA DLX6-AS1+anti-miR-NC組、H2O2+si-LncRNA DLX6-AS1+ anti-miR-103a-3p組。僅轉染si-NC、轉染si-LncRNA DLX6-AS1、轉染pcDNA-NC、轉染pcDNA-LncRNA DLX6-AS1的H9C2細胞分別記為si-NC組、si-LncRNA DLX6-AS1組、pcDNA-NC組、pcDNA-LncRNA DLX6-AS1組。

1.3 RT-qPCR檢測LncRNA DLX6-AS1和miR-103a-3p表達 用Trizol試劑提取H9C2細胞的總RNA，使用cDNA第一鏈合成試劑盒將2 μg總RNA進行逆轉錄反應。采用SYBR Green Real-time PCR Master Mix進行RT-qPCR。反應條件為95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，70℃ 10 s，共40個循環。引物序列如下。2-△△Ct方法分析LncRNA DLX6-AS1和miR-103a-3p相對表達量。LncRNA DLX6-AS1上游引物5’TGATCCTGGGGAGCTACGAA3’；下游引物5’TTGAGCAACTTCCACGCTCA3’；內參GAPDH上游引物5’-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3’，下游引物5’-TGATGGCAACAATGTCCACT-3’；miR-103a-3p上游引物5’-ACACTCCAGCTGGGAGCAGCATTGTACAGGG-3’，下游引物5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；內參U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組H9C2細胞，用冷PBS洗滌2次，在暗室環境下按照Annexin-V-FITC/PI說明書染色。流式細胞術確定FITC或PI陽性細胞比例記為細胞凋亡率。

1.5 試劑盒檢測MDA水平、LDH和SOD活性 分別收集H2O2孵育各組H9C2細胞或培養液上清，采用LDH檢測試劑盒測量上清液中LDH活性。取1 ml提取液加入各組細胞沉淀中，超聲波裂解細胞，收集上清液，4℃離心機10 000 r/min離心10 min，按照MDA檢測試劑盒、SOD活性檢測試劑盒分別測定H9C2細胞中MDA水平、SOD活性。

1.6 ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β和IL-6水平 分別收集H2O2孵育后各組細胞培養液上清，3 000 r/min離心10 min去除顆粒和聚合物，按照ELISA試劑盒說明書步驟進行操作。

1.7 Western blot檢測Cleaved-caspase-3蛋白表達 用RIPA法裂解各組H9C2細胞，收集上清液，二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量。等量蛋白樣品經SDS-PAGE分離后，用半干轉膜儀轉移蛋白至硝酸纖維素膜上。室溫條件下，用5%脫脂牛奶孵育膜1 h，隨后用1∶1 000稀釋的Cleaved-caspase-3一抗與膜反應2 h，再加入二抗孵育1 h。最后，滴加化學發光試劑檢測進行顯色。Quantify One軟件分析Cleaved-caspase-3和GAPDH蛋白條帶的灰度值，以二者的比值表示Cleaved-caspase-3蛋白表達量。

1.8 雙熒光素素酶報告實驗 根據Starbase軟件預測的LncRNA DLX6-AS1和miR-103a-3p結合位點，構建含有與miR-103a-3p結合序列位點的野生(WT)或突變(MUT)DLX6-AS1序列。隨后將其克隆到基本載體pGL3中構建熒光素酶報告載體WT-DLX6-AS1、MUT-DLX6-AS1。然后，參照Lipofectamine 2000說明書將上述載體分別與miR-103a-3p mimics、miR-NC各自共轉染H9C2細胞，雙熒光素酶活性測定試劑盒測量轉染48 h后H9C2細胞的相對熒光素酶活性。

2 結果

2.1 LncRNA DLX6-AS1和miR-103a-3p在H2O2誘導的H9C2細胞中的表達 H2O2組H9C2細胞中LncRNA DLX6-AS1表達量與NC組比較顯著升高(P<0.05)，而miR-103a-3pDLX6-AS1表達量與NC組比較顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 DLX6-AS1和miR-103a-3p在H2O2誘導的H9C2細胞中的表達

2.2 下調LncRNA DLX6-AS1抑制H2O2誘導心肌細胞H9C2凋亡、氧化應激和炎性反應 與NC組比較，H2O2組H9C2細胞LncRNA DLX6-AS1表達量顯著升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白表達、凋亡率、MDA含量、LDH釋放量顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)，TNF-α、IL-1β和IL-6的水平顯著升高(P<0.05)；與si-NC+H2O2組比較，si-LncRNA DLX6-AS1+H2O2組H9C2細胞LncRNA DLX6-AS1表達量顯著降低(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白表達、凋亡率、MDA含量、LDH釋放量顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)，TNF-α、IL-1β和IL-6的水平顯著降低(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 下調LncRNA DLX6-AS1抑制H2O2誘導心肌細胞H9C2凋亡、氧化應激和炎性反應；A Western blot檢測Cleaved-caspase-3表達；B 流式細胞儀檢測細胞凋亡

表2 下調LncRNA DLX6-AS1抑制H2O2誘導心肌細胞H9C2凋亡、氧化應激和炎性反應

2.3 上調miR-103a-3p抑制H2O2誘導心肌細胞H9C2凋亡、氧化應激和炎性反應 與miR-NC+H2O2組比較，miR-103a-3p+H2O2組H9C2細胞miR-103a-3p表達量顯著升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白表達量、細胞凋亡率、MDA含量、LDH釋放量顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)，TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 Western blot檢測Cleaved-caspase-3表達

表3 miR-103a-3p抑制H2O2誘導心肌細胞H9C2凋亡、氧化應激和炎性反應

2.4 LncRNA DLX6-AS1靶向負調控miR-103a-3p表達 Starbase數據庫預測到LncRNA DLX6-AS1序列與miR-103a-3p序列間存在特異互補結合位點。與轉染miR-NC組比較，轉染miR-103a-3p mimics后H9C2細胞WT-DLX6-AS1的相對熒光素酶活性明顯下降(P<0.05)，而MUT-DLX6-AS1的相對熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)。pcDNA-LncRNA DLX6-AS1組H9C2細胞miR-103a-3p表達量與pcDNA-NC組比較顯著降低(P<0.05)；si-LncRNA DLX6-AS1組H9C2細胞miR-103a-3p表達量與si-NC組比較顯著升高(P<0.05)。見圖3，表4、5。

圖3 LncRNA DLX6-AS1和miR-103a-3p結合位點示意圖

2.5 下調miR-103a-3p可逆轉下調LncRNA DLX6-AS1對H2O2誘導心肌細胞H9C2凋亡、氧化應激和炎性反應的保護作用 與anti-miR-NC+si-LncRNA DLX6-AS1+H2O2組比較，anti-miR-103a-3p+si-LncRNADLX6-AS1+H2O2組H9C2細胞miR-103a-3p表達量顯著降低(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白表達量、細胞凋亡率、MDA含量、LDH釋放量，TNF-α、IL-1β和IL-6的水平顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)。見圖4,表6。

表4 相對熒光素酶活性檢測

表5 RT-qPCR檢測miR-103a-3p表達

圖4 Western blot檢測Cleaved-caspase-3表達

表6 下調miR-103a-3p可以逆轉下調LncRNA DLX6-AS1對H2O2誘導心肌細胞H9C2凋亡、氧化應激和炎性反應的保護作用

3 討論

LncRNA是一類蛋白編碼能力缺失的RNA分子，在基因組印記、表觀遺傳調控等生物過程中發揮調節作用，是多種心血管疾病的潛在調控因子[8]。研究顯示I/R可導致心肌細胞中LncRNA表達失調，進而影響線粒體穩態、細胞凋亡、自噬和壞死等多種細胞功能，提示LncRNA在對抗I/R損傷引起的心肌功能失調方面可能具有巨大潛力[9]。LncRNA DLX6-AS1包含1990個核苷酸，研究證實甲狀腺癌、胃癌、宮頸癌中DLX6-AS1表達上調，下調DLX6-AS1表達通過抑制癌細胞的惡性增殖、遷移和侵襲能力，誘導細胞凋亡，具有抗腫瘤作用[10-12]。最近研究發現，在脂多糖誘導的急性腎損傷中，LncRNA DLX6-AS1通過靶向miR-223-3p軸介導脂多糖誘導的腎小管上皮細胞毒性和焦亡[13]。下調LncRNA DLX6-AS1還可改善腦I/R所致的神經損傷[14]。

本研究結果表明，在H2O2誘導的H9C2細胞模型中LncRNA DLX6-AS1表達量顯著上調控，提示LncRNA DLX6-AS1表達改變可能參與心肌I/R損傷進展。功能實驗表明，下調LncRNA DLX6-AS1表達顯著減弱H2O2誘導的H9C2細胞凋亡，抑制MDA水平和LDH釋放量，增加H9C2細胞SOD活性，并降低炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，這說明干擾LncRNA DLX6-AS1表達可抑制I/R后心肌心肌炎癥和氧化應激。此外，下調LncRNA DLX6-AS1表達后，凋亡執行因子Cleaved-caspase-3表達明顯降低，與其抗凋亡作用吻合。因此，LncRNA DLX6-AS1在心肌I/R損傷過程中起著重要的調控作用，可作為治療心肌I/R損傷的潛在靶點。

miRNA是一類高度保守且普遍存在的內源性短鏈RNA分子，其通過促進降解或抑制靶mRNA的翻譯來調控多種細胞功能。在心肌I/R損傷中，miRNA表達失調與心肌細胞壞死、凋亡、心肌炎癥、纖維化等多種病理過程有關，lncRNA通過調控miRNA可加劇或減輕心肌I/R損傷[15-17]。本研究發現，在H2O2處理的H9C2細胞中miR-103a-3p表達顯著降低，上調miR-103a-3p表達顯著抑制MDA水平和LDH釋放，提高SOD活性，降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平，下調Cleaved-caspase-3蛋白表達，進而抑制H2O2誘導的H9C2細胞炎性反應、氧化損傷和凋亡。與本研究發現的保護作用類似，Li等[18]的研究證實miR-103a-3p可抑制炎性因子分泌，減弱氧化應激，抑制細胞凋亡進而減弱腦I/R模型大鼠腦損傷。Chen等[19]報道miR-103a-3p還可減輕膿毒癥誘導的炎性因子分泌和肝細胞凋亡，減輕肝臟損傷。

熒光素酶實驗證實miR-103a-3p是的LncRNA DLX6-AS1的下游靶點。此外，上調或下調LncRNA DLX6-AS1表達可分別降低或增加miR-103a-3p表達水平，提示LncRNA DLX6-AS1在心肌I/R損傷的作用可能是介導miR-103a-3p實現的。進一步分析顯示，下調miR-103a-3p表達顯著減弱LncRNA DLX6-AS1下調對H2O2誘導的H9C2細胞凋亡、炎性反應和氧化損傷的影響，這說明下調LncRNA DLX6-AS1對心肌I/R損傷的保護作用至少部分與上調miR-103a-3p有關。

總之，下調LncRNA DLX6-AS1可通過靶向miR-103a-3p顯著抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡、氧化應激損傷和炎性反應。LncRNA DLX6-AS1/miR-103a-3p可能是治療心肌I/R損傷的新靶點。