纈沙坦/氨氯地平通過調控miR-21對心肌缺血/再灌注損傷大鼠的保護作用及機制研究

秦少博，黃增剛

(1.西安市第一醫(yī)院心血管內科，陜西 西安 710002；2.安康市中醫(yī)醫(yī)院制劑中心，陜西 安康 725000)

心肌缺血/再灌注損傷(Myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)是指心肌組織缺血后恢復血流灌注而發(fā)生的心肌組織損傷加重甚至出現(xiàn)不可逆性損傷的病理過程，可加重心功能障礙和心肌結構的破壞，嚴重威脅患者的生命健康安全[1]。MIRI的發(fā)生機制尚不明確，目前研究[2-3]認為其病理生理過程涉及氧自由基增多、炎性細胞因子過表達、鈣超載和能量代謝障礙等，故目前臨床防治MIRI主要通過抑制炎性反應、抗氧化、減輕鈣超載和能量代謝障礙以及保護血管內皮細胞等途徑[4]。纈沙坦/氨氯地平為血管緊張素受體拮抗劑(Angiotensin receptor blockers,ARBs)纈沙坦與鈣通道阻滯劑(Calcium channel blockers,CCBs)氨氯地平的復方制劑，臨床廣泛應用于原發(fā)性高血壓的治療。臨床實驗[5]表明，ARBs具有抗炎、抗心肌細胞凋亡、抗動脈粥樣硬化和對抗梗死后交感神經重構等作用，已逐步成為各類心血管疾病的常用治療藥物之一。CCBs具有抗炎、抗氧化應激、改善血管內皮功能和中性粒細胞聚集的作用，并可通過阻斷鈣離子跨膜轉運，改善鈣超載[6]。既往研究[7]還發(fā)現(xiàn)，ARBs和CCBs類藥物除發(fā)揮降壓作用，具有獨立于該作用之外改善心率變異性、逆轉左心室肥厚、縮短動脈粥樣硬化斑塊等靶器官保護作用，對存在靶器官損傷的高血壓患者療效更好。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類高度保守的短鏈內源性非編碼RNA，成熟的miRNA可與靶mRNA的3’端非編碼區(qū)(3’-Untranslated regions,3’-UTR)相結合，沉默或降解靶基因，進而調控基因的表達，在調節(jié)細胞生長、發(fā)育、增殖、分化和凋亡過程中均起重要作用[8]。已有多項研究[9-10]認為，miR-21參與了多種心血管系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，通過細胞凋亡和自噬途徑，調控心律失常、心肌肥厚、心肌細胞損傷等多個生理病理過程。然而，纈沙坦/氨氯地平對MIRI有無療效、miR-21是否參與了MIRI的病程、其具體分子機制如何，目前鮮有報道。因此，本研究通過給予MIRI模型大鼠纈沙坦/氨氯地平，觀察其對大鼠心肌組織的保護作用，并探究其可能的作用機制，以期為臨床治療MIRI提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：選取健康雄性SPF級SD大鼠30只，8周齡，體重(180±10)g，西安微元生物醫(yī)藥研究所有限公司，許可證號：SYXK(陜)2020-006，常規(guī)飼養(yǎng)于潔凈動物房內，恒溫恒濕，正常晝夜交替，自由攝食攝水。

1.1.2 藥品及試劑：纈沙坦/氨氯地平片(80 mg/5 mg，國藥準字J20150135)；注射用青霉素鈉80萬U(國藥準字H20033934)；水合氯醛、DMSO、RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)；DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、MTT(美國Gibco)；BCA蛋白測定試劑盒、Trizol試劑、逆轉錄試劑盒(Invitrogen公司)；抗過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(Peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α,PGC-1α)抗體、核呼吸因子1(Nuclear respiratory factor 1,NRF1)抗體、線粒體轉錄因子A(Mitochondrial transcription factor A,TFAM)抗體(美國Sigma公司)。

1.1.3 主要儀器：超低溫冰箱、細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；電子天平(瑞士METTLERTOLEDO公司)；石蠟組織切片機(德國Leica公司)；激光共聚焦顯微鏡(尼康儀器有限公司)；實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；紫外分光光度儀(日本島津公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及MIRI模型建立：將30只大鼠隨機分為假手術組、模型組和治療組，每組10只。模型組和治療組均建立MIRI模型：腹腔注射10%水合氯醛溶液，待麻醉效果滿意后固定大鼠于手術臺上，氣管插管接呼吸機輔助呼吸，胸部備皮，碘伏常規(guī)消毒，胸腔正中切1.5～2 cm切口，剪開心包，用無損傷線結扎冠狀動脈左前降支30 min，剪斷扎線，恢復血流灌注，建立MIRI模型。假手術組僅開胸，不結扎。術后腹腔注射80萬U/d青霉素預防感染，連續(xù)注射3 d。灌胃給予治療組30 mg/kg的纈沙坦/氨氯地平藥物混懸液，假手術組和模型組給予等體積的生理鹽水，共連續(xù)給藥8周。

1.2.2 取樣及處理：治療結束后，頸椎脫臼處死大鼠，碘伏消毒，打開胸腔，斷開肋骨，取出整個心臟，分離左心室，冰冷的無菌PBS洗滌，立即稱重后置于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 心肌組織形態(tài)學觀察：取各組部分心肌組織，10%甲醛溶液固定，乙醇脫水，石蠟包埋，切5 μm厚連續(xù)切片，HE染色，中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)學變化。

1.2.4 心肌梗死面積比例：取各組部分心肌組織病理切片，稱重，沿白色心肌梗死區(qū)域邊緣切下梗死心肌組織，稱重，計算梗死心肌占總心肌的比例。

1.2.5 心肌細胞生存率：取各組部分心肌組織，剪碎，勻漿，RIPA裂解液裂解消化，用DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)至第三代，用PBS調整細胞懸液計數(shù)為1×106個/ml，接種于96孔板，每孔100 μl，每組各設置6個復孔，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后吸棄上清，加入DMSO溶解結晶，震蕩10 min，于490 nm波長下測定各孔吸光度值(OD)。

1.2.6 各組心肌組織中miR-21和PGC-1α、NRF1、TFAM mRNA的相對表達：分別取各組心肌組織，稱重，冰冷水浴中剪碎、研磨，采用Trizol試劑提取各組中的總RNA，于260 nm和280 nm波長下測定吸光度A，計算純度和濃度。用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA進行PCR反應，反應條件如下：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性20 s、65 ℃退火延伸15 s共38個循環(huán)。以u6作為內參，采用2-△△CT法計算各組中miR-21和PGC-1α、NRF1、TFAM mRNA的相對表達量，引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結 果

2.1 心肌組織形態(tài)學觀察 模型組大鼠心肌組織可見心肌纖維和間質壞死，大量炎性細胞浸潤，間質水腫，心肌纖維化，嗜酸性粒細胞增強，大量心肌細胞核呈現(xiàn)碎裂或變性狀。治療組心肌組織形態(tài)基本趨于正常，心肌纖維基本排列整齊，可見少量炎性細胞浸潤，間質水腫明顯改善，心肌細胞胞漿染色較為均勻。假手術組大鼠心肌組織基本正常，可見極少量炎性浸潤，心肌細胞形態(tài)正常。見圖1。

A：假手術組；B：模型組；C：治療組

2.2 各組大鼠心肌梗死面積比例比較 三組大鼠心肌梗死面積比例相比具有統(tǒng)計學差異(均P<0.05)；三組之間兩兩相比，模型組心肌梗死面積比例顯著高于假手術組(均P<0.05)；治療組心肌梗死面積比例顯著低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠心肌梗死面積比例比較(%)

2.3 各組大鼠心肌細胞生存率比較 三組大鼠心肌細胞生存率相比差異具有統(tǒng)計學意義(F=516.857,P<0.05)；三組之間兩兩相比，模型組心肌細胞生存率顯著低于假手術組(均P<0.05)；治療組心肌細胞生存率顯著高于模型組(P<0.05)。見圖2。

2.4 各組大鼠心肌組織中miR-21相對表達比較 三組心肌組織中miR-21的相對表達比較具有統(tǒng)計學差異(F=78.375,P<0.05)；三組之間兩兩相比，模型組心肌組織中miR-21的相對表達顯著高于假手術組(均P<0.05)；治療組心肌組織中miR-21的相對表達顯著低于模型組(P<0.05)。見圖3。

2.5 各組大鼠心肌組織中PGC-1α、NRF1、TFAM mRNA表達比較 三組大鼠心肌組織中PGC-1α、NRF1和TFAM mRNA的相對表達比較具有統(tǒng)計學差異(均P<0.05)；三組之間兩兩相比，模型組心肌組織中PGC-1α、NRF1和TFAM mRNA的相對表達顯著低于假手術組(均P<0.05)；治療組心肌組織中PGC-1α、NRF1和TFAM mRNA的相對表達顯著高于模型組(P<0.05)。見表3。

注：與假手術組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

注：與假手術組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

表3 各組大鼠心肌組織中PGC-1α、NRF1、TFAM mRNA表達比較

3 討 論

缺血性心臟病目前已成為威脅人類生命健康的主要心血管疾病之一，盡快恢復缺血區(qū)血流灌注為最主要的治療方法，然而，MIRI為臨床治療缺血性心臟病過程中最常見的病理損傷之一，可導致患者出現(xiàn)心肌梗死面積擴大、心功能下降、心律失常甚至猝死，嚴重影響缺血性心臟病患者的預后和生命安全[11]。

既往研究[12]認為，MIRI可能與血管內皮細胞(Endothelial cell,EC)功能障礙有關，EC釋放的一氧化氮(Nitric oxide,NO)在心血管生理病理進程中發(fā)揮至關重要的作用，冠脈血管內皮源性NO釋放的減少可能是EC功能障礙發(fā)生的主要早期事件。氨氯地平、硝苯地平、拉西地平等CCBs類藥物與血管內皮依賴性舒張功能密切相關，可通過調節(jié)NO活性、促進NO的釋放而發(fā)揮保護心臟的作用；此外，CCBs還可阻礙心肌組織和血管平滑肌的鈣離子的跨膜轉運，抑制鈣離子內流，改善鈣超載[13]。Guo等[14]在高膽固醇血癥模型大鼠的體內試驗中發(fā)現(xiàn)，缺血期給予氨氯地平可顯著上調內皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、下調誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase， iNOS)，下調灌注早期NOS和iNOS的表達水平，糾正血管EC功能失調，從而發(fā)揮保護缺血缺氧心肌的作用。纈沙坦作為ARBs的代表藥物，具有降血壓，逆轉血管重塑和左心室，保護腎功能，預防心力衰竭、心肌梗死后心臟和血管的重構等作用，已成為眾多心血管疾病的常用藥物之一。基礎研究[15]表明，在心肌缺血/再灌注過程中，心肌組織和血液循環(huán)中的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system,RAS)被激活，心肌組織和血液中的AngⅡ大量釋放，其可誘導心肌細胞內鈣超載，增加能量消耗，降低NOS的活性，從而損傷血管內皮細胞和心肌細胞。而ARBs可選擇性、競爭性的與血管緊張素Ⅱ1型受體(Angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1)結合，從而阻滯AngⅡ所介導的生物學效應，保護心肌細胞，減小心肌梗死面積。除此之外，ARBs可借助于其結構中的酚醛基團發(fā)揮清除自由基的功能，從而起到抗炎作用[16]。

本研究中，HE染色結果顯示模型組大鼠心肌組織可見心肌纖維和間質壞死，炎性細胞浸潤和間質水腫明顯，嗜酸性粒細胞增強，大量心肌細胞核呈現(xiàn)碎裂或變性狀，而治療組大鼠心肌組織的上述表現(xiàn)明顯改善，心肌形態(tài)趨于正常，僅可見少量炎性細胞浸潤和間質水腫；比較各組大鼠心肌梗死面積，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠心肌梗死面積比例顯著高于假手術組，而治療組的心肌梗死面積比例較模型組顯著降低；此外，模型組大鼠心肌細胞生存率顯著低于假手術組，而治療組的心肌細胞生存率顯著高于模型組，上述結果均提示纈沙坦/氨氯地平可顯著改善MIRI模型大鼠心肌組織的病理損傷，減少心肌梗死面積以及MIRI引起的心肌細胞凋亡。

miRNA是一類長度約為20～24個核苷酸的高度保守的內源性單鏈非編碼RNA，是真核生物體內重要的調控基因表達的分子，可通過沉默靶基因，影響翻譯過程，從而抑制蛋白的表達，對細胞的增殖、分化、凋亡、壞死及自噬等等諸多方面產生巨大的影響[17]。MIRI是一種涉及心肌細胞凋亡、壞死、自噬等復雜的病理生理過程，往往伴隨著多種miRNA的異常表達。miR-21作為一種廣泛存在于機體組織器官中且靶基因眾多的miRNA，近年來的不斷深入研究[18-19]表明，其在急性冠脈綜合征、心力衰竭、高氧性急性肺損傷(Hyperoxi induced acute lung iniury,HALI)、心肌細胞氧化應激、MIRI、肝臟和腎臟缺血再灌注損傷等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中均呈現(xiàn)異常表達。李童等[20]研究發(fā)現(xiàn)，MIRI模型大鼠心肌組織中miR-21、miR-126的表達顯著上調。Olson等[21]的研究表明，miR-21可通過作用于靶基因PDCD4來調控缺血/再灌注損傷及心肌細胞氧化應激。本研究結果同樣顯示，模型組大鼠心肌組織中miR-21的相對表達顯著高于假手術組，提示miR-21可能參與了MIRI的病理進程；而經纈沙坦/氨氯地平治療后，治療組大鼠心肌組織中miR-21的相對表達顯著降低，提示纈沙坦/氨氯地平可通過調控miR-21的表達而發(fā)揮對MIRI大鼠心肌的保護作用。

進一步的機制通路研究發(fā)現(xiàn)，MIRI模型大鼠心肌組織中的miR-21的下游關鍵基因PGC-1α、NRF1和TFAM mRNA的相對表達均顯著低于假手術組；而經纈沙坦/氨氯地平治療后，治療組大鼠心肌組織中PGC-1α、NRF1和TFAM mRNA的相對表達顯著升高。PGC-1α為氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)及脂肪酸氧化的最主要轉錄因子之一，可通過影響線粒體的生物合成和生理功能，并同時輔助活化NFR1和NFR2，提高心肌細胞在環(huán)境變化時對能量需求的變化[22]。Tran等[23]通過敲除小鼠的PGC-1α基因，發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟對缺血的耐受力明顯減弱，小鼠腎功能與PGC-1α的表達呈正相關。NRF1可通過調節(jié)核基因組編碼呼吸鏈亞基的表達和調控TFAM的途徑影響基因組的轉錄和翻譯等[24]。TFAM可通過調節(jié)線粒體DNA(mitochondria NDA,mtDNA)的輕鏈和重鏈的轉錄從而調控miRNA的轉錄和復制[25]。本研究結果提示miR-21及其下游基因可能參與了MIRI的調控，而通過上調PGC-1α、NRF1和TFAM mRNA的相對表達可對MIRI大鼠的心肌組織發(fā)揮保護作用。

綜上所述，纈沙坦/氨氯地平對MIRI 模型大鼠的心肌組織具有良好的保護作用，其機制可能與下調miR-21的表達而上調其下游基因基因PGC-1α、NRF1和TFAM的表達有關，對miR-21表達的調控有望成為臨床治療MIRI的新靶點之一。