真菌毒素測試儀應用及校準方法的研究

周華文 王光躍 王曉紅

摘要：真菌毒素是指絲狀真菌在糧食和飼料中生長產生的有毒次級代謝產物，極易污染各類農產品，對人體和動物危害極大;真菌毒素測試儀是一種快檢儀器，可以對糧食存放產生的真菌毒素含量進行快速有效的測量，對食品、飼料安全檢測初篩發揮著重要的作用;真菌毒素測試儀的量值準確性直接關系到糧食初篩的科學與否。論文簡單分析了真菌毒素測量的重要性和現階段真菌毒素測試儀的校準狀況;通過分析真菌毒素測試儀的各項技術指標，找出關鍵量值的評價方法，確定了真菌毒素測試儀的校準方法。

關鍵詞：真菌毒素 校準方法 糧食安全

Mycotoxin Tester Application and Research on Calibration Method

Zhou Huawen1 ， Wang Guangyue1，Wang Xiaohong2

（1. Binzhou Inspection and Testing Center; 2. Shandong Yuntang Intelligent Technology Co.， LTD）

Abstract： Mycotoxins are toxic secondary metabolites produced by filamentous fungi growing in grain and feed. It is very easy to pollute all kinds of agricultural products，great harm to human body and animals. Mycotoxin tester is a fast detection instrument， which can quickly and effectively measure the content of mycotoxin produced by grain storage，and plays an important role in the preliminary screening of food and feed safety detection. The accuracy of mycotoxin tester is directly related to the qualification of primary screening of food and feed.This paper briefly analyzes the importance of mycotoxin measurement and the calibration of mycotoxin tester at present. By analyzing the technical indexes of mycotoxin tester， the evaluation method of key quantity value is found out，and the calibration method of mycotoxin tester is determined.

Key words： mycotoxins， calibration method， food safety

0 引言

當前國家糧食供給處在緊平衡狀態，疫情下糧食出口國停止出口，當下倉儲糧的安全事關糧食安全的關鍵。目前真菌毒素已知種類有400余種，我國GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》、GB 13078—2017 《飼料衛生標準》都對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、黃曲霉素B1、黃曲霉素M1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉素、展青毒素做出了限量要求;真菌毒素測試儀是一種快檢儀器，由于真菌毒素快速檢測儀器的檢測速度快、檢測成本低等特點，在市場、家庭、食堂餐廳等領域應用廣泛，提升了食品安全檢測的效率，擴大了食品檢測的范圍，對于更科學有效的管理食品安全市場發揮重要的作用;真菌毒素測試儀的正確使用及該設備的量值準確可靠是控制糧食不受感染的重要保障。

1 真菌毒素測試儀在糧食安全中的重要性

真菌毒素測試儀應用于糧食收儲企業、食品制造業、牲畜飼料生產業，特別是糧食收儲企業，因糧食飼料在收獲時未被充分干燥或貯運過程中溫度或濕度過高，都可能使糧食飼料上的真菌迅速生長，真菌毒素就是真菌生長產生的有毒次級代謝產物。幾乎所有在糧食倉庫中生長的真菌（倉貯真菌）都侵染種胚造成谷物萌發率下降，同時產生毒素。這都需要使用真菌毒素測試儀進行實時檢測和控制。因此，真菌毒素測試儀的使用和校準必須準確可靠。

2 常見的兩種真菌毒素測試儀

2.1 熒光定量免疫層析技術檢測法真菌毒素測試儀

定義：免疫層析技術又名側向流免疫層析，是一種色譜分析技術。該技術是將已知的抗原或抗體預先偶聯到載體上作為捕獲線，待檢測樣本在載體的毛細作用帶動下流經捕獲線，若樣本中存在相應的抗體或者抗原，就能和載體上的抗原或抗體發生特異性反應而吸附到載體上，并通過標記物顯色或者發光以確定是否含待測物或者待測物的含量。

熒光免疫層析技術，是將免疫熒光技術和免疫層析技術相結合發展創新的一種定量新型檢測技術。該技術是用熒光微球與抗體結合形成熒光標記抗體，通過抗原抗體反應對待測物進行檢測。該技術不但保留膠體金免疫層析技術操作簡便、檢測快速、便攜性強的優點外，還通過熒光示蹤增強技術實現了檢測結果的精確定量。

熒光定量免疫層析技術是在熒光免疫層析技術的基礎上，通過熒光定量檢測儀對待測物進行定量檢測。免疫微球標記的熒光物質在特定波長光的照射下會發出熒光，儀器會根據熒光的發光強度，通過儀器預置的標準曲線，對待測物質做到定量檢測。

2.2 膠體金定量檢測法真菌毒素測試儀

糧食行業標準LS/T 6111—2015《糧油檢驗 糧食中黃曲霉毒素B1測定 膠體金快速定量法》、LS/T 6112—2015《糧油檢驗 糧食中玉米赤霉烯酮測定 膠體金快速定量法》、LS/T 6113—2015《糧油檢驗 糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定 膠體金快速定量法》、LS/T 6114—2015《糧油檢驗 糧食中赭曲霉素毒素A測定 膠體金快速定量法》要求的膠體金快速定量技術，免疫膠體金技術（Immune colloidal gold technique）是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。膠體金是由氯金酸（HAuCl4 ）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下， 聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，稱為膠體金。膠體金在弱堿環境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。膠體金層析抗原抗體反應在纖維素膜上，從而使標記膠體金的抗體在檢測線、質控線上聚集， 從而形成可以被肉眼觀察到的紅色條帶。

膠體金定量免疫層析技術是在膠體金免疫層析技術的基礎上通過膠體金定量檢測儀對待測物質進行定量檢測。膠體金定量檢測儀通過對膠體金檢測卡的檢測線和質控線進行光密度掃描，依據檢測線和質控線顏色的深淺，通過儀器預置的標準曲線對待測物質進行定量檢測。

3 膠體金定量檢測法與熒光定量免疫層析技術檢測法本質區別

3.1 標記技術不同

熒光定量免疫層析產品以功能化納米微球為載體技術，結合熒光標記物探針，儀器直接檢測激發熒光信號而非傳統金標定量所采用的CCD表層光密度掃描技術。檢測信號具有較高的信噪比、更高的信號檢測量和檢測靈敏度。

3.2 載體結合方式不同

膠體金免疫層析技術采用物理吸附的方法結合，抗原/抗體容易從金顆粒表面脫離，標記物不穩定。由于膠體金技術的原理缺陷和無法攻克的技術難點，故膠體金免疫層析技術，通常適用于定性或者半定量現場快速檢測，無法給出精準定量的檢測結果。熒光免疫層析技術采取的是化學偶聯的吸附方法，抗原/抗體結合能力強，不易脫落，檢測結果較為精準。兩種檢測方法對比情況見表1。

4 真菌毒素測試儀的正確使用

毒素熒光定量快速檢測卡具有方便、快速、靈敏等特點，適用于現場大批量樣品檢測。本試劑將毒素包被抗原在硝酸纖維素膜上劃線包被，作為檢測線，用羊抗兔多抗在硝酸纖維素膜上劃線包被制成質控線。將鼠抗毒素單克隆抗體標記上乳膠熒光微球與兔IgG標記的乳膠熒光微球混勻后噴涂在玻璃纖維素膜上制備成標記物墊。硝酸纖維素膜靠近質控線的一端覆蓋上吸水墊，靠近檢測線的另一端覆蓋標記物墊。往標記物墊上加入標準品溶液或待測樣本提取液，抗原就會與標記物混合反應并沿著硝酸纖維素膜層析，分別與檢測線和質控線反應。當測試結果有效時，質控線顯示一定光強度。這時檢測線上的光信號強度與質控線上的光信號強度的比值（T/C）與樣本濃度呈負相關，通過標準曲線計算即可得出待測樣品濃度。

除嚴格按儀器說明操作外，不同批號的試劑和檢測卡不能混用，檢測卡干燥保存;加樣操作應快速準確手法一致，溶液不能沾到壁上，盡量縮短整個加樣時間 ，加樣完畢后將檢測卡水平靜置于恒溫器中等待層析反應，嚴格控制反應時間， 檢測卡開封后立即使用，一次性使用的檢測卡不得重復使用，檢測必須符合實驗室管理規范的規定，嚴格防止交叉污染。樣品、洗棄液和各種廢棄物處理都應符合實驗室廢棄物處理辦法并盡快處理。

5 真菌毒素測試儀的校準

5.1 現狀

真菌毒素測試儀的生產沒有相應國家標準，沒有統一的儀器校準規范，不能對不同廠家研發生產的同類型儀器的計量性能進行統一規范，不能保證儀器量值準確性，從而影響到對谷物中真菌毒素的含量控制，進而影響食品安全;食品安全不僅關系到廣大人民群眾的身體健康和生命安全，而且與經濟的健康發展和社會的和諧穩定密切相關。目前沒有發現有機構開展真菌毒素測試儀相關的檢測校準，也沒有相關的真菌毒素測試儀校準的文獻。

5.2 制定校準方法的意義

校準規范的制定一是可解決儀器無統一校準規范的問題，保證各計量機構采用統一的標準物質或標準計量器具，按統一的校準方法進行校準，為儀器量值準確可靠提供技術保障;二是通過規范制定后開展定期的校準活動，使儀器得到正常維護，保證檢測儀器的計量特性指標符合相關標準的基本參數要求;三是通過制定規范，為相關儀器的生產、驗貨交易、糾紛仲裁等提供可供參考的技術依據。

5.3 真菌毒素測試儀的校準步驟

5.3.1 以乙腈中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇溶液標準物質的稀釋液為平行樣，以真菌毒素測試儀測試其熒光值，按照公式（1）得到擬合曲線，然后根據其測量值，按照式（2）計算相關系數。

式中：

x——稀釋液濃度值;

y——熒光值;

b——擬合曲線斜率;

a——擬合曲線截距;

r——相關系數;

xi——第i個濃度點稀釋液濃度值;

yi——第i個濃度點熒光值;

x ——稀釋液濃度值的平均值;

y ——熒光值的平均值。

5.3.2 計算測量重復性：重復測量中濃度的乙腈中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇溶液標準物質的稀釋液的熒光值，計算實驗標準偏差s。

5.3.3 計算最小檢出值：重復測量空白樣品的熒光值，取熒光值的平均值為y，取y-3s作為最小檢出值。

6 結束語

本文分析了真菌毒素測量的重要性和真菌毒素測試儀工作原理以及現階段真菌毒素測試儀的校準狀況;通過分析真菌毒素測試儀的各項技術指標，實現了對真菌毒素測試儀的校準工作，解決了真菌毒素測試儀不能校準的難題;該方法主要使用的是國家二級標準物質，能夠滿足擴展不確定度小于被校準設備最大允許誤差的1/3的要求，對真菌毒素測試儀要求合理、切實可行，可操作性強。

參考文獻

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