ALDH1A1調控Notch1信號通路在MMSCs“干性”維持中的作用和機制研究

王曉麗 江妤 曾玉曉 劉永華 章俏雷

[摘要] 目的 研究乙酰脫氫酶家族成員A1（ALDH1A1）調控Notch1信號通路在多發性骨髓瘤干細胞（MMSCs）“干性”維持中的作用和機制。 方法 選用人MMSCs CD138-B細胞和人正常干細胞QSG-7701，用Western blot法檢測ALDH1A1在CD138-B細胞和QSG-7701細胞中的表達情況。將CD138-B細胞分為control組、ALDH1A1敲減組、Notch1通路抑制劑組，control組不作任何處理，ALDH1A1敲減組轉染10 μg ALDH1A1-shRNA重組慢病毒質粒，Notch1通路抑制劑組加入20 μmol/L Notch1通路抑制劑GSI，培養48 h，檢測并比較三組ALDH1A1表達量、Notch1通路相關蛋白[Notch1、發狀分裂相關增強子1（Hes1）]表達量、增殖率、凋亡率及“干性”相關基因[胚胎干細胞關鍵蛋白（NANOG）、八聚體結合轉錄因子4（OCT4）]表達量。結果 CD138-B細胞中ALDH1A1蛋白表達量較QSG-7701細胞明顯增加（P<0.05）;ALDH1A1敲減組ALDH1A1蛋白表達量較control組明顯減少（P<0.05）;Notch1通路抑制劑組ALDH1A1蛋白表達量與control組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。ALDH1A1敲減組和Notch1通路抑制劑組增殖率及Notch1、Hes1蛋白和NANOG、OCT4基因表達量較control組明顯減少（P<0.05），凋亡率較control組明顯增多（P<0.05）;Notch1通路抑制劑組增殖率、凋亡率及Notch1、Hes1蛋白和NANOG、OCT4基因表達量與ALDH1A1敲減組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結論 ALDH1A1在MMSCs中呈高表達，ALDH1A1敲減后可通過阻抑Notch1信號通路下調MMSCs“干性”維持，抑制MMSCs增殖并誘導其凋亡。

[關鍵詞] 乙酰脫氫酶家族成員A1;Notch1信號通路;多發性骨髓瘤干細胞;表達水平;干性維持;細胞增殖;細胞凋亡

[中圖分類號] R733.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）07-0021-04

Study on the role and mechanism of ALDH1A1 regulating Notch1 signaling pathway in stemness maintenance of MMSCs

WANG Xiaoli JIANG Yu ZENG Yuxiao LIU Yonghua ZHANG Qiaolei

Department of Hematology， Lishui People′s Hospital in Zhejiang Province， Lishui? ?323000， China

[Abstract] Objective To investigate the role and mechanism of aldehyde dehydrogenase family 1 member A1 （ALDH1A1） in regulating the Notch1 signaling pathway in the stemness maintenance of multiple myeloma stem cells （MMSCs）. Methods Human MMSCs CD138-B cells and human normal stem cells QSG-7701 were selected to detect the expression of ALDH1A1 in CD138-B cells and QSG-7701 cells by Western blot. CD138-B cells were divided into the control group， the ALDH1A1 knockdown group and the Notch1 pathway inhibitor group. The control group was not treated with any treatment. The ALDH1A1 knockdown group was transfected with 10 μg ALDH1A1-shRNA recombinant lentiviral plasmid. The Notch1 pathway inhibitor group was added with 20 μmol/L Notch1 pathway inhibitor GSI and cultured for 48 h. The expression levels of ALDH1A1， Notch1 pathway related proteins （Notch1， hair division associated enhancer 1 [Hes1]）， proliferation rate， apoptosis rate and stemness related genes （embryonic stem cell key protein [NANOG]， octamer binding transcription factor 4 [OCT4]） were detected and compared among the three groups. Results The expression of ALDH1A1 protein in CD138-B cells was significantly higher than that in QSG-7701 cells （P<0.05）. The protein expression of ALDH1A1 in the ALDH1A1 knockdown group was significantly lower than that in the control group （P<0.05）. No significant difference was observed in the ALDH1A1 protein expression in the Notch1 pathway inhibitor group compared with the control group （P>0.05）. The proliferation rates and the expression levels of Notch1 and Hes1 proteins and NANOG and OCT4 genes in the ALDH1A1 knockdown group and the Notch1 pathway inhibitor group were significantly decreased compared with the control group （P<0.05）， and the apoptosis rates were significantly increased compared with the control group （P<0.05）. No significant differences were observed in the proliferation rate， apoptosis rate， and the expressions of Notch1， Hes1， NANOG and OCT4 gene in the Notch1 pathway inhibitor group compared with the ALDH1A1 knockdown group（P>0.05）. Conclusion ALDH1A1 is highly expressed in MMSCs. Knockdown of ALDH1A1 can inhibit the stemness maintenance of MMSCs by inhibiting the Notch1 signaling pathway， inhibit the proliferation of MMSCs and induce their apoptosis.

[Key words] ALDH1A1; Notch1 signaling pathway; Multiple myeloma stem cells; Expression level; Stemness maintenance; Cell proliferation; Apoptosis

多發性骨髓瘤為血液系統惡性腫瘤，發病率約為1/10萬，好發于老年人群，特征是克隆性漿細胞在骨髓中惡性增生，造成相關組織或器官損傷[1]。其臨床表現是貧血、骨骼損害、高鈣血癥、腎功能損害等[2]。目前沙利度胺、硼替佐米等新藥以及造血干細胞移植在多發性骨髓瘤治療中的應用使患者生存期有所延長，但該病伴有高風險的復發，完全治愈十分困難[3]。治療后復發被認為與多發性骨髓瘤干細胞（multiple myeloma stem cells，MMSCs）有關，這些干細胞有腫瘤起始、自我更新及化療藥物耐藥的潛能，現有干預方案可能只清除多發性骨髓瘤細胞，而對其干細胞的干預作用不明顯[4]。乙酰脫氫酶家族成員A1（aldehyde dehydrogenase family 1 member A1，ALDH1A1）是干細胞標志物之一，能夠促進腫瘤的發生和進展，如乳腺癌、肺癌等[5]。Notch1信號通路是一條進化上十分保守的信號通路，涉及細胞增殖、凋亡、分化、上皮-間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）及干細胞自我更新等過程，該通路異常可能導致腫瘤的形成[6]。以往研究顯示[7]，ALDH1A1與腫瘤干細胞干性關系密切，但其與MMSCs干性和生物學行為的關系及機制尚不清楚。因此，本研究分析ALDH1A1調控Notch1信號通路在MMSCs干性維持及增殖、凋亡中的作用和機制，希望為臨床治療多發性骨髓瘤提供新的干預靶點，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

人MMSCs CD138-B細胞（北京埃克森科技有限公司）;人正常干細胞QSG-7701（上海雅吉生物科技有限公司）;ALDH1A1-shRNA重組慢病毒質粒（武漢維克賽思科技有限公司）;Notch1通路抑制劑GSI（上海翊圣生物科技有限公司）;CCK-8溶液（上海富衡生物科技有限公司）;PI染液、Annexin V-FITC（北京拜爾迪生物技術有限公司）;BCA蛋白定量試劑盒（上海梵態生物科技有限公司）;兔抗ALDH1A1單克隆抗體（上海群己生物科技有限公司）、兔抗β-actin單克隆抗體（武漢亞科因生物技術有限公司）;山羊抗兔IgG二抗（上海研卉生物科技有限公司）;ECL發光試劑盒（廣州市智取生物科技有限公司）;兔抗Notch1單克隆抗體、兔抗Hes1單克隆抗體（上海嶸崴達實業有限公司）;總RNA提取試劑盒（北京伊塔生物科技有限公司）;反轉錄試劑盒（上海百賽生物技術有限公司）。

1.2 實驗分組

將CD138-B細胞和QSG-7701細胞進行原代培養，收集其對數生長期的相應細胞，接種于6孔細胞培養板中，每孔4×105個為細胞接種密度，用DMEM培養基（含有10%胎牛血清），在37℃（5%、CO2）條件下培養，待細胞在培養基中的生長密度達80%～90%時用于以下實驗。

將CD138-B細胞分為control組、ALDH1A1敲減組、Notch1通路抑制劑組，control組不作任何處理，ALDH1A1敲減組轉染10 μg ALDH1A1-shRNA重組慢病毒質粒，Notch1通路抑制劑組加入20 μmol/L Notch1通路抑制劑GSI，繼續培養48 h，48 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）表達情況，傳代后，換用L15培養液[含有嘌呤霉素（2 μg/ml）]進行篩選，得到穩定傳代的細胞克隆。上述過程中的轉染操作按照LipofectamineTM2000轉染說明書進行。

1.3 采用CCK8法檢測三組CD138-B細胞增殖率

取1.2項下的三組細胞，制成單細胞懸液，以5×105/ml接種于96孔板（每孔100 μl），待細胞貼壁后加入CCK-8溶液（每孔10 μl），37℃培養120 min，用酶標儀測定570 nm波長處各孔吸光度（A）值，增殖率計算公式為[1-（處理組A/對照組A）×100%]。

1.4采用流式細胞術檢測三組CD138-B細胞凋亡率

取1.2項下的三組細胞，制成單細胞懸液，加入250 μl EMSA/Gel-Shift結合緩沖液（5X）將細胞重懸，再加入5 μl Annexin V-FITC、5 μl PI染液，避光條件下反應15 min，然后用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.5采用Western blot法檢測ALDH1A1在CD138-B細胞和QSG-7701細胞中的表達情況

取1.2項下的CD138-B細胞和QSG-7701細胞，勻漿，裂解，離心，收集上清，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度并定量，取總蛋白上樣，電泳，切膠，轉膜，封閉，加入兔抗ALDH1A1單克隆抗體（1∶300稀釋）、兔抗β-actin單克隆抗體（1∶200稀釋），4℃孵育過夜，洗膜，加入山羊抗兔IgG二抗（堿性磷酸酶標記，1∶3000稀釋），37℃孵育1 h，洗膜，用ECL發光試劑盒曝光顯影，用Image Lab軟件對目的蛋白（ALDH1A1）和內參蛋白（β-actin）的灰度值進行分析，目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值為最終結果。

1.6采用Western blot法檢測ALDH1A1及Notch1通路相關蛋白[Notch1、發狀分裂相關增強子1（hairy and enhancer of split 1，Hes1）]在三組中的表達情況

取1.2項下的三組CD138-B細胞，勻漿，裂解，離心，收集上清，測定蛋白濃度并定量，取總蛋白上樣，電泳，切膠，轉膜，封閉，加入Notch1、Hes1一抗（1∶500稀釋）及ALDH1A1一抗和β-actin一抗，4℃孵育過夜，洗膜，加入山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育1 h，洗膜，曝光顯影，用Image Quant TL軟件分析各條條帶的灰度值。

1.7采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（real time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測“干性”相關基因在三組CD138-B細胞中的表達量

取1.2項下的三組細胞，用細胞總RNA提取試劑盒提取總RNA，用反轉錄試劑盒將其反轉錄成cDNA，然后在T100 PCR儀上進行PCR擴增。擴增體系為：1 μl cDNA模板，10 μl SYBR Premix Ex Taq，上下游引物各0.5 μl，加無核酶水將體系補充至20 μl;反應條件為：95℃條件下預變性15 s，95℃條件下變性5 s，57℃條件下復性30 s，72℃條件下延伸30 s，循環共42個;引物序列見表1。根據擴增曲線準確讀取循環閾值（cycle threshold，Ct），內參照為GAPDH基因，用相對定量法以2 -△△Ct表示NANOG、八聚體結合轉錄因子4（octamer-binding transcription factor-4，OCT4）基因表達量。

1.8統計學方法

所有實驗重復3次。采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組之間的計量資料比較用t檢驗，三組之間的計量資料比較用單因素方差分析（其中兩兩計量資料比較采用SNK-Q檢驗）。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ALDH1A1在CD138-B細胞和QSG-7701細胞中的表達情況

與QSG-7701細胞（0.74±0.16）比較，CD138-B細胞中ALDH1A1蛋白表達量（2.92±0.97）明顯增加（t=3.841，P=0.018）。

2.2 ALDH1A1及Notch1通路相關蛋白在三組中的表達情況

ALDH1A1敲減組ALDH1A1蛋白表達量較control組明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05）;Notch1通路抑制劑組ALDH1A1蛋白表達量與control組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。ALDH1A1敲減組和Notch1通路抑制劑組Notch1、Hes1蛋白表達量較control組明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05）;Notch1通路抑制劑組Notch1、Hes1蛋白表達量與ALDH1A1敲減組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2、圖1。

2.3 “干性”相關基因在三組中的表達情況

ALDH1A1敲減組和Notch1通路抑制劑組NANOG、OCT4基因表達量較control組明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05）;Notch1通路抑制劑組NANOG、OCT4基因表達量與control組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

2.4 三組增殖和凋亡情況

ALDH1A1敲減組和Notch1通路抑制劑組增殖率較control組明顯減少（P<0.05），凋亡率較control組明顯增多（P<0.05）;Notch1通路抑制劑組增殖率和凋亡率與ALDH1A1敲減組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表4、封三圖1。

3 討論

腫瘤干細胞是腫瘤形成的根源，也是腫瘤細胞對放化療抵抗的根本[8]。降低MMSCs的“干性”對于提高多發性骨髓瘤療效有重要意義。ALDH是一種胞質酶，能夠催化乙醛氧化為乙酸，在機體代謝中具有重要作用，與腫瘤的形成存在一定關系[9]。ALDH1為ALDH家族中的重要成員，可將視黃醇氧化為視黃酸，然后與視黃酸受體-α（retinoic acid receptor-α，RAR-α）結合而參與多種組織分化和基因調控[10]。ALDH1在多種腫瘤干細胞中處于高表達狀態。ALDH1A1是ALDH1的亞型之一，在結腸癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤細胞中表達異常，并與這些腫瘤細胞的侵襲和轉移有關[11]。相關文獻報道，ALDH1A1過表達后小鼠的成瘤能力更強，且“干性”增強[12]。研究顯示ALDH1A1表達水平與乳腺癌組織學分級、淋巴結轉移、TNM分期關系密切，而與腫瘤大小、年齡無關，ALDH1A1高表達患者的生存期縮短明顯，提示ALDH1A1在乳腺癌惡性轉化過程中有著促進作用，其水平檢測有助于判斷乳腺癌惡性程度和預后情況[13]。學者發現，ALDH1A1在喉鱗癌Hep2腫瘤細胞中呈高表達，且其高表達能夠促進Hep2細胞增殖并誘導其凋亡[14]。相關報告指出，ALDH1A1表達水平升高是肺癌預后的危險因素，ALDH1A1可作為肺癌腫瘤干細胞（lung cancer stem cells，LCSCs）表面標志物[15]。本研究中，CD138-B細胞中ALDH1A1蛋白表達量較QSG-7701細胞明顯增加，提示ALDH1A1在MMSCs中呈高表達，ALDH1A1可能與多發性骨髓瘤發生有關;ALDH1A1敲減組ALDH1A1蛋白表達量較control組明顯減少，提示ALDH1A1-shRNA重組慢病毒質粒轉染成功;ALDH1A1敲減組增殖率及NANOG、OCT4基因表達量較control組明顯減少，凋亡率較control組明顯增多，提示敲減ALDHlAl后可下調MMSCs“干性”維持，抑制MMSCs增殖并誘導其凋亡。

Notch1通路是存在于大部分細胞生物體中的配體-受體信號通路，在細胞生物學行為如生長、分化、代謝、增殖等中起重要作用，其在惡性腫瘤中的作用也備受關注[16]。Hes1是調控Notch1通路的關鍵靶基因之一，檢查Hes1表達情況可判斷該通路的活化程度[17]。研究顯示，Notch1通路在前列腺癌中呈現高度激活狀態，該通路受到抑制后可減弱腫瘤細胞的增殖能力，Notch1及下游的靶基因Hes1在卵巢癌中有異常高表達，抑制其表達后能夠促進卵巢癌細胞凋亡[18]。GSI為Notch1信號第3步酶切反應，能夠阻礙Notch1胞內段Nicd釋放，使細胞增殖及分化受到影響[19]。文獻顯示，GSI能夠阻斷Notch1通路在前列腺癌和乳腺癌等腫瘤細胞中的表達[20]。本研究用GSI抑制MMSCs中的Notch1通路，分析ALDH1A1是否通過調控Notch1通路對MMSCs干性維持及增殖、凋亡發揮作用，結果顯示ALDH1A1敲減組Notch1、Hes1蛋白表達量較control組明顯減少，提示ALDH1A1敲減后Notch1通路處于抑制狀態;Notch1通路抑制劑組增殖率及Notch1、Hes1蛋白和NANOG、OCT4基因表達量較control組明顯減少，凋亡率較control組明顯增多，且上述指標在ALDH1A1敲減組和Notchl通路抑制劑組中無明顯差異，提示ALDH1A1對MMSCs“干性”、增殖、凋亡的作用機制與Notchl信號通路有關。

綜上所述，ALDH1A1敲減后可通過阻抑Notch1信號通路下調MMSCs“干性”維持，抑制MMSCs增殖并誘導其凋亡。但ALDH1A1對MMSCs“干性”及生物學行為是否還有其他調控機制，有待進一步研究。

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（收稿日期：2021-03-11）