γ-干擾素釋放試驗在新版肺結核診斷標準中的應用研究

龍妍帆 許光輝 蒙是升 陳華 甄志斌 陳漢欽 黃燊德

【摘要】目的：探討γ-干擾素釋放試驗（IGRA）對診斷肺結核病的價值。方法：選取2019年4月至2020年12月住院的525例肺結核患者為觀察組，122例除肺結核以外其他存在肺部陰影的肺部疾病患者為對照組，對觀察組的患者同時細分為非活動性肺結核45例、活動性菌陰肺結核182例、僅培陽肺結核120例、涂陽肺結核178例，均進行結核分枝桿菌涂片、培養、痰GeneXpert.MTB/RIF、結核菌素試驗、結核抗體檢測、IGRA 檢測。結果：同其他的5種檢測方式相比， IGRA 在陽性檢出率上明顯更高（P<0.05）; IGRA 檢測不同分組的 T-N 值上存在顯著差異性，且兩兩組間比較差異有統計學意義（P<0.05）; IGRA 對活動性肺結核的診斷靈敏度為92.92%、特異度為74.85%、陽性預測值為91.39%、陰性預測值為78.62%。結論： IGRA 對新版肺結核的診斷價值顯著。

【關鍵詞】γ-干擾素釋放試驗;肺結核;診斷

【中圖分類號】R521【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-5249（2022）05-0035-03

肺結核是一種致死性的慢性傳染性疾病，統計數據表明我國肺結核的患病率非常高，總的發病率占到世界的第二位，因此盡早的檢出肺結核疾病具有重要意義[1]。在對肺結核的診斷上，常規的檢查方式包括痰涂片檢查、痰 GeneXpert MTB/RIF 檢測、痰培養方法，然而這些方式往往存在漏診誤診的情況，使得實際篩查肺結節存在一定難度。γ-干擾素釋放試驗（interferon gamma release assays，IGRA）屬于結核病診斷的一種新的方式，這一方式有較好的敏感性與特異性[2]。本次研究中，采取了回顧性分析方式，探討將IGRA應用于新版肺結核診斷中的價值，報告如下。

1 對象與方法

1.1研究對象

選取2019年4月至2020年12月收治的525例住院肺結核患者為觀察組，同時細分為非活動性肺結核45例、活動性菌陰肺結核182例、僅培陽肺結核120例、涂陽肺結核178例。觀察組中男367例，女158例;年齡17～84（51.86±2.26）歲。選擇同時期收治的除肺結核以外其他存在肺部陰影的肺部疾病患者122例作為對照組，其中男83例，女39例;年齡18～83（53.52±2.29）歲。兩組患者性別與年齡資料比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

納入標準：（1）肺結核診斷符合《肺結核診斷和治療指南》[3]的標準，其他肺部疾病的診斷則是參照中華醫學會呼吸病學分會的相關進行診斷指南診斷;（2）精神狀態良好且有正常溝通能力;（3）自愿參加研究且簽署同意書。

排除標準：（1）合并血液系統疾病者;（2）嚴重呼吸道感染者;（3）精神疾病者。

1.2方法

1.2.1留痰方法

囑咐患者先用清水漱口數次，清除口腔內部食物殘渣以及部分雜菌，留取患者用力咳出的氣管內痰液，痰量應在3 mL以上，將采集的痰標本置于專用痰盒并且即刻送檢，注意避免唾液與鼻涕吐如痰盒。

1.2.2檢查方法

（1）痰菌檢測，留取即時、夜間痰、第2天晨起痰標本3份，每份均取適量痰液制成涂片，經萋一苊氏染色鏡檢抗酸桿菌（AFB），按規范進行痰涂片檢查。

（2）痰 GeneXpert MTB/RIF 檢測，按檢測儀器、試劑盒說明書進行操作。

（3）藥敏試驗法，針對談痰樣本結核分枝桿菌培養陽性，取培養基上3周新鮮菌落，借助比例法進行藥敏試驗，按規范嚴格操作。

（4）結核菌素試驗，對前臂掌側中下三分之一部位進行消毒處理，經皮內注射5 U PDD液，囑咐患者72h 禁止洗浴，避免用激素類藥物，注射72 h 觀察結果，借助卡尺對硬結橫徑與縱徑檢查，平均直徑為橫縱徑之和的一半，硬結平均直徑≥5 mm 為陽性。

（5）血清結核抗體檢測，常規采集血清，應用結核抗體檢測專用盒檢測，嚴格按儀器與試劑說明書操作。主要方法是應用肝素抗凝的5 mL靜脈血液，均分為5份置于96孔板上，4孔分別加植物血凝素（pHA）5μg/ mL、純蛋白衍生物（ppD）5μL、6 kDa早期分泌性抗原靶0.3 mL、培養濾液蛋白-100.3 mL，最后一空不加抗原作為空白孔。將孔板置于37℃環境下，環境中 5%CO2，濕度為95%，持續培養16～24h后測定

（6）IGRA，采集治療前的血清，借助結核抗體檢測專用試劑盒檢測，試劑按儀器和試劑說明書操作。具體方法如下。①標準的稀釋液在蒸餾水調和下，完成10倍液體稀釋處理;②依據樣品類型差異，試劑盒提供具備兩類標準稀釋液，生物液中含蛋白酶/細胞因子結合蛋白，這樣可更變測定因子，依據標準品予以稀釋并配置標準制品。細胞培養的上清液通過標準稀釋液做稀釋處理，稀釋的方法是血清/血漿用人血標準稀釋液，做持續性稀釋處理，根據微孔數量，經干燥玻璃管予以稀釋處理。按瓶上標注的量應用標準稀釋緩沖液配制干擾素-γ（INF γ）濃度為400 pg/mL;③生物素標記抗INF-γ應用生物素標記抗體稀釋液，依據微孔數在干凈的玻璃管予以稀釋，此外進行親和素-HRP、緩沖液稀釋;④試劑充分混勻，將稀釋的對照品以及樣品逐次加入至96孔酶標板，各孔內均是加入50μL 最新配置的INF-γ溶液，且配置的溶液還經生物素標記。借助酶標儀分光光度儀讀數，測量波長450 nm，參考波長620 nm，以平均光吸收值為Y軸，對應INF-γ為X軸，樣本INF-γ濃度經標準曲線上樣本OD 值確定。結果判定：測試培養管（T）含量值、本地對照組培養管（N）含量值，以T-N表示，單位pg/mL。

1.3統計學方法

運用 SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料用（±s）表示，使用 t 檢驗;計數資料用[ n（%）]表示，使用χ2檢驗。計算本單位結核分枝桿菌涂片、培養、 GeneXpert MTB/RIF、結核菌素試驗、γ-干擾素釋放試驗五種方法的檢測陽性率，γ-干擾素釋放試驗在活動性肺結核患者中的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值。

2 結果

2.1各組檢測結果

觀察組肺結核不同分組，經IGRA在檢出陽性例數上明顯高于其他5種檢查方法（P<0.05），見表1。

2.2 IGRA不同分組T-N值

經 IGRA 顯示，不同分組的T-N值存在差異，其中對照組最低，涂陽肺結核最高，兩兩組間對比差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3 IGRA診斷結核感染的價值

活動性和非活動性肺結核共525例，經IGRA 診斷的靈敏度為90.67%、特異度為90.16%、陽性預測值為97.54%、陰性預測值為69.18%。

2.4 IGRA診斷活動性肺結核的價值

對活動性肺結核組的480例，經IGRA 診斷的靈敏度為92.92%、特異度為74.85%、陽性預測值為91.39%、陰性預測值為78.62%。

3 討論

結核病是當前全世界成人傳染病主要殺手，對全球居民生命安全均構成嚴重威脅。我國屬于結核病高負擔國家，結核病的總患病人數也讓處在世界的第二位，具體數據是大約5.5億人感染結核病菌，面對急劇升高的結核病發病，加強結核病感染防控至關重要[4]。對肺結核的篩查是我國防治傳染病的有效方式，長期以來主要是應用結核分枝桿菌涂片、痰培養、 GeneXpert MTB/RIF、結核菌素試驗方式。其中結核分枝桿菌涂片檢查采集痰液標本制成涂片，觀察結核分枝桿菌分布，痰培養基本類似[5]。 GeneXpert MTB/ RIF屬于半巢式實施熒光定量 PCR體外診斷手段，主要作用是能夠測定結核分枝桿菌，同時還對于利福平耐藥性測定有積極作用，其優勢是比傳統涂片更能檢出含菌量低的標本，適用于多個標本的測定。結核菌素試驗則結合皮內菌素測定，觀察注射位置基本情況，確定結合桿菌感染引起的超敏反應，該試驗手段的敏感性較高驗[6]。而以上診斷方式雖然在操作上比較簡單，但是漏診誤診率往往比較高，一些檢查方式的花費時間較長，比如痰培養的檢測費用卻比較高，這樣使得常規的方法難以滿足臨床篩查及早期診斷肺結核的隨機需求[7]。 GeneXpert MTB/RIF 容易受到收費標準、試劑供應、檢測成本以及臨床醫生認知等因素的影響，尤其是受限于昂貴的試劑價格，若是檢測試劑未納入醫保就會給患者帶來巨大經濟負擔。結核分枝桿菌涂片檢查缺點在于不管是陽性結果還是陰性結果，均無法確診患者結核病患病與否，檢測方式的精確度及特異度比較差。

結核分枝桿菌是引起結核病的主要抗原，結核分枝桿菌則是一種兼性細胞內的寄生菌，常是寄生到巨噬細胞，人體感染結核分枝桿菌，在感染部位經抗原遞呈，對抗原處理，抗原經由組織相容抗原分子，遞呈特異性免疫細胞[8]。結核特異性 CD4+T 細胞則屬于輔助T細胞，主要是能同時生成大量細胞因子，關鍵的作用在于抑制INF-γ生成。機體INF-γ下降的同時，免疫功能指標也隨之下降，人體在受結核桿菌感染后發生疾病，若是INF-γ處在較低值也可出現病程遷延情況，進一步使得病情加重，有鑒于INF-γ在結核分枝桿菌感染中的關鍵作用，測定INF-γ就對于肺結核病的檢出有一定價值[9]。而在既往一直是應用靜脈血中分泌的單核細胞對INF-γ濃度測定，然而這一方式復雜并且費事費力，同時需要的血液量較大，因此并不適用兒童、老年群體，而全血檢測則能克服傳統檢測方式的缺點。近年來隨著結核分枝桿菌RDI 區的發展，通過早期分泌型抗原靶點蛋白以及培養濾過蛋白-10等區域編碼蛋白為特異性抗原做體外 IGRA檢驗，這樣使得肺結核的早期檢出率更高[10]。應用 IGRA對肺結核的檢驗，基本原理主要是人體在初次感染結核分枝桿菌后，體內會存在致敏淋巴細胞，若是再一次的接觸到結核桿菌抗原，致敏性淋巴細胞會被迅速的活化成效應淋巴細胞，同時也生成較高水平的細胞因子，重要細胞因子就是INF-γ[11]。采取 IGRA 的方式，檢測T淋巴細胞所釋放的INF-γ的指標水平，判定受檢者是否存在結核桿菌感染的情況，這樣為肺結核的診斷提供有利幫助[12-13]。在本次研究中，觀察了采取6種不同的方式對于肺結核診斷的價值，結果顯示在對觀察組肺結核不同分組的陽性檢出情況上，經IGRA 的方式明顯要比結核分枝桿菌涂片、培養、 GeneXpert MTB/RIF、結核抗體檢測、結核菌素試驗的方式陽性檢出率高。表明應用IGRA 對肺結核的診斷準確率高，是一種可行性的方案。在對不同分組經 IGRA 檢出T-N值得情況上，各組數值差異明顯，兩兩組間對比差異有統計學意義，表明應用IGRA 對肺結核的診斷，可以為疾病類型的鑒別提供有利參考，輔助醫師合理治療疾病。此外對活動性肺結核，經 IGRA 的診斷價值上，敏感度與陽性預測值均在90%以上，同樣表明 IGRA 用于活動性肺結核診斷中有重要作用。

綜上所述，對肺結核的臨床診斷，應用INF-γ釋放試驗的檢查方式，在陽性檢出率上比傳統結核分枝桿菌涂片、痰培養等方式的陽性檢出率更高，通過試驗可顯示不同肺結核病變的數值差異，輔助疾病的鑒別，這樣可為臨床醫師應用合理方式治療疾病提供有利參考，因此值得在臨床中推廣應用。本次研究也存在一定的局限性，在接下來的工作中需著力設計更加嚴謹的實驗方案及納入更大樣本例數的研究對象，讓結果有代表性，此外本研究選擇的對照組為未患肺結核的肺部疾患，對健康群體未做試驗研究，后續也可通過增加組別數量以獲得更加系統的結果。

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（收稿日期：2021-09-22）