產(chǎn)前診斷中額外小標(biāo)記染色體的臨床及遺傳學(xué)分析*

李燕青，傅婉玉，王元白，江矞穎，蘇景明，莊建龍

福建省泉州市婦幼保健院/兒童醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心,福建泉州 362000

額外小標(biāo)記染色體(sSMC)是指不能通過細(xì)胞遺傳學(xué)常規(guī)顯帶方法辨認(rèn)的染色體結(jié)構(gòu)畸變，其大小通常等于或小于同一個(gè)中期染色體核型中的20號(hào)染色體[1]。sSMC的表型效應(yīng)取決于它的來源、片段大小和常染色質(zhì)所占比例。由于sSMC本身形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，無法用傳統(tǒng)G顯帶技術(shù)判斷其來源，而分子遺傳學(xué)檢測(cè)能協(xié)助判斷sSMC的來源,為臨床咨詢提供更精準(zhǔn)有益的信息。本研究對(duì)泉州市婦幼保健院/兒童醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心經(jīng)產(chǎn)前羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析檢出sSMC的病例進(jìn)行分析，并對(duì)部分病例采用單核苷酸多態(tài)性微陣列(SNP-array)檢測(cè)sSMC的來源，以進(jìn)一步明確其致病性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2020年3月于泉州市婦幼保健院/兒童醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心就診的高危孕婦5 766例。產(chǎn)前診斷納入指征包括高齡孕婦(≥35周歲)、胎兒超聲檢查結(jié)果異常、有不良孕產(chǎn)史、孕中期血清學(xué)產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)等。所有孕婦均有詳細(xì)的病歷資料和體格檢查資料，并完善術(shù)前檢查排除穿刺手術(shù)禁忌證，同時(shí)簽署知情同意書。本研究經(jīng)泉州市婦幼保健院/兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：2020No.31)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析 在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取20 mL羊水用于羊水細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)7～10 d后用胰酶消化法進(jìn)行細(xì)胞收獲，通過自動(dòng)染色體收獲系統(tǒng)Sinochrome Chromprep Ⅱ(上海樂晨生物科技有限公司)進(jìn)行染色體制備，經(jīng)吉姆薩染液染色后進(jìn)行核型分析。采集夫妻雙方外周血標(biāo)本于無菌條件下接種至Chromed P細(xì)胞培養(yǎng)基中，分兩瓶培養(yǎng)68～72 h后分別收獲、制片、染色、染色體核型分析。羊水細(xì)胞計(jì)數(shù)30個(gè)核型，并分析5個(gè)核型。外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)20個(gè)核型，并分析5個(gè)核型。染色體的命名依據(jù)人類細(xì)胞基因組學(xué)國際命名體系(ISCN 2016)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3SNP-array檢測(cè) 采集孕婦10 mL羊水標(biāo)本及夫妻雙方外周血標(biāo)本各3 mL送至第三方檢測(cè)公司(北京貝康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所)進(jìn)行檢測(cè)，離心收集沉淀，采用DNA提取試劑盒提取羊水/外周血細(xì)胞基因組DNA，經(jīng)稀釋消化、擴(kuò)增、純化后，形成25 bp的片段。將芯片上的探針與生物素標(biāo)記后的相應(yīng)堿基片段進(jìn)行雜交、洗滌、結(jié)合染色后放入Affymetrix公司GeneChip Scanner 3000Dx v.2 with AutoLoaderDx掃描儀進(jìn)行掃描，采用Chromosome Analysis Suite(ChAS)v4.0軟件對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行分析。通過數(shù)據(jù)庫查詢判讀拷貝數(shù)變異(CNVs)的致病性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和分析。

2 結(jié) 果

2.1羊水染色體核型分析結(jié)果 檢出sSMC的胎兒共7例，其中嵌合型3例，1例伴有18-三體綜合征，見表1。

表1 檢出sSMC胎兒的羊水染色體核型、SNP-array檢測(cè)結(jié)果、父母驗(yàn)證及妊娠結(jié)局

2.2SNP-array檢測(cè)結(jié)果 7例檢出sSMC的胎兒中有4例進(jìn)行了SNP-array檢測(cè)，其中2例sSMC分別來源于X和Y染色體,2例未檢出CNVs。病例1中羊水染色體核型提示mos45，X[27]/46，X，+mar[23]，SNP-array檢測(cè)結(jié)果顯示為男性胎兒，該胎兒在性染色體Y上的擬常染色體區(qū)域存在2處缺失，因此羊水染色體核型更正為mos45，X[27]/46，X，del(Y)(q11.221)[23]。病例2 SNP-array檢測(cè)結(jié)果顯示為女性胎兒，X染色體存在3處缺失，羊水染色體核型更正為45，X[35]/46，X，del(X),(Xp11.22q13.3)。病例3和病例4 SNP-array檢測(cè)結(jié)果未見異常，見表1。

2.3妊娠結(jié)局及父母驗(yàn)證 病例1及病例2經(jīng)SNP-array檢測(cè)提示胎兒性染色體嵌合異常，均為致病性變異，父母驗(yàn)證無異常，顯示胎兒攜帶的sSMC為新發(fā)突變。病例1于妊娠26周引產(chǎn)一男性無生機(jī)兒，外觀未見明顯異常；病例2引產(chǎn)一女，外觀未見明顯異常。病例3及病例4因SNP-array檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)異常CNVs，均選擇繼續(xù)妊娠，后期隨訪胎兒體健。此外，3例未行SNP-array檢測(cè)的病例中有1例因合并胎兒18-三體綜合征選擇終止妊娠；1例因合并胎兒復(fù)雜型先天性心臟病選擇終止妊娠；1例因父母驗(yàn)證提示胎兒sSMC遺傳自其表型正常的父親，孕婦及其家屬選擇繼續(xù)妊娠，后期隨訪顯示胎兒出生后未見異常。見表1。

3 討 論

據(jù)報(bào)道，約1 000例行染色體核型分析的羊水穿刺標(biāo)本中就可檢出1例存在sSMC的病例[2]。sSMC的遺傳效應(yīng)差異很大，大多數(shù)對(duì)個(gè)體無影響，但也有10%～15%可導(dǎo)致嚴(yán)重智力低下和其他異常表型，明確sSMC來源對(duì)臨床產(chǎn)前咨詢尤其重要[3]。

SNP-array檢測(cè)有助于明確sSMC來源[4-5]。本研究中2例通過SNP-array檢測(cè)明確sSMC為性染色體來源的致病性變異，病例1羊水染色體核型為mos45，X[27]/46，X，+mar[23]，SNP-array檢測(cè)結(jié)果提示sSMC來源于部分缺失的Y染色體，最終病例1羊水染色體核型更正為mos45，X[27]/46，X，del(Y)(q11.221)[23]。胎兒Y染色體存在涉及無精癥因子(AZF)區(qū)段及Y染色體性別決定區(qū)(SRY)等OMIM基因相關(guān)區(qū)域的2處缺失，同時(shí)胎兒在Xq28或者Yq12區(qū)段存在291.8 Kb的缺失，在Xp22.33或Yp11.32區(qū)段存在包含SHOX等基因的2.2 Mb的嵌合缺失。SHOX基因的單倍劑量不足會(huì)導(dǎo)致身材矮小[6]。位于Y染色體短臂遠(yuǎn)端的SRY基因在胚胎早期原始性腺組織分化過程中起著關(guān)鍵作用，SRY基因的缺失可能導(dǎo)致性器官發(fā)育異常[6]。徐丹萍等[7]總結(jié)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，嵌合型Y染色體長臂大片段缺失的存活個(gè)體中，34.8%(8/23)存在身材矮小的情況(原因尚不明確)，大部分男性患者存在陰莖結(jié)構(gòu)正常但伴有尿道下裂。病例1存在涉及Y染色體的多處缺失，不僅影響胎兒的性別及生長發(fā)育，還會(huì)影響其成年后的生育問題，因此孕婦及家屬選擇終止妊娠。

胎兒NT增厚與染色體異常和部分結(jié)構(gòu)畸形密切相關(guān)[8]。病例2因胎兒NT增厚要求進(jìn)行產(chǎn)前診斷，羊水染色體核型為45,X[35]/46，X，+mar[15]，SNP-array檢測(cè)明確該sSMC為部分缺失的X染色體，羊水染色體核型更正為45,X[35]/46,X,del(X),(Xp11.22q13.3)。在45,X基礎(chǔ)上發(fā)生的sSMC并不影響Turner綜合征表型[9]。研究表明，約32.6%的嵌合型Turner綜合征患者中有一些自發(fā)的青春期發(fā)育表現(xiàn)，但最終繼發(fā)閉經(jīng)，其可能與Xq13-q26區(qū)域缺失導(dǎo)致卵巢功能相關(guān)基因的單倍劑量不足有關(guān)，臨床表型為卵巢功能障礙、性腺發(fā)育障礙、原發(fā)閉經(jīng)等，需要長期激素替代治療[10-11]。

產(chǎn)前診斷中發(fā)現(xiàn)的sSMC是否有表型效應(yīng)，與sSMC的染色體來源、基因組含量、家族再發(fā)性，是否為嵌合型和嵌合度，是否存在單親二倍體效應(yīng)等因素有關(guān)[12-15]。本研究中病例7因胎兒sSMC遺傳自其表型正常的父親，推測(cè)胎兒出現(xiàn)異常表型的風(fēng)險(xiǎn)低，建議孕婦繼續(xù)妊娠,后期隨訪顯示胎兒出生后健康狀況良好。約30%的sSMC遺傳自父母，由表型正常的父親或母親傳遞而來的sSMC通常不增加子代異常表型的風(fēng)險(xiǎn)[16]，因此首先建議對(duì)胎兒的父母進(jìn)行染色體核型分析,幫助判斷胎兒的sSMC來源[9]。

sSMC大部分來源于近端著絲粒染色體[17-18]。本研究中病例3及病例4的SNP-arry檢測(cè)結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)異常，提示sSMC來源于探針未覆蓋的異染色質(zhì)區(qū)，來源于異染色質(zhì)區(qū)的sSMC通常是不致病的[17]。

sSMC形態(tài)學(xué)的多樣性，如何評(píng)價(jià)其對(duì)胎兒的影響，以及是否需要終止妊娠等，是產(chǎn)前遺傳咨詢面臨的重要問題，盡快明確sSMC的來源尤為重要，因此將分子遺傳學(xué)與細(xì)胞遺傳學(xué)方法相結(jié)合對(duì)明確sSMC的來源及致病性有重要意義，可為產(chǎn)前遺傳咨詢及妊娠結(jié)局評(píng)估提供參考。