臍帶血miR-499-5p、PTEN在缺氧缺血性腦病新生兒中的水平變化及臨床意義

王紅娥

新鄭市人民醫院新生兒科，河南鄭州 451100

新生兒出生前、出生時和出生后窒息是導致新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)發病和死亡的重要因素。25%的新生兒HIE會出現嚴重的永久性神經系統后遺癥，包括智力低下、腦癱和癲癇等[1]。微小RNA (miRNA) 是一組非編碼RNA，長度為18～22個核苷酸，其在人體體液中穩定存在，并且可以從血清中檢出[2]。miRNA已被證明與多種疾病的發病機制有關，可以作為較好的疾病診斷指標[3]。微小RNA-374a和微小RNA-181b與HIE疾病進展有關[4]。 最近的一項研究顯示，微小RNA-499-5p(miR-499-5p)可抑制C反應蛋白的產生并在新生大鼠HIE中發揮神經保護功能[5]。位于人類19號染色體上的磷酸酯酶與張力蛋白同源物 (PTEN) 基因編碼一種雙磷酸酶，可使蛋白質和脂質底物脫磷酸化[6]。此外，PTEN是磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (PI3K/Akt) 信號通路的負調節因子，與缺氧缺血性損傷有關[7]。PTEN可調節腫瘤組織和健康組織中的血管生成，而腦微血管生成對于腦損傷后功能恢復是非常必要的[8]。然而，目前尚不明確腦組織中miR-499-5p減輕缺血缺氧損傷的功能是否依賴于PTEN信號通路。因此，本研究對HIE新生兒臍帶血中的miR-499-5p、PTEN水平進行了分析，并探討其關系，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2020年4月本院收治的61例HIE新生兒為研究對象，納入標準：(1)足月新生兒；(2) HIE診斷通過腦部MRI證實。排除標準：(1)合并顱內出血、電解質紊亂或產傷引起的驚厥；(2)合并高膽紅素血癥、宮內感染或嚴重腦發育不良引起的腦損傷。根據新生兒HIE嚴重程度判斷標準，將HIE新生兒分為HIE輕度、中度和重度組,分別為27例、21例、13例。選取同期50例健康新生兒作為對照組，對照組均為新生兒疾病篩查無異常且無圍生期窒息或神經系統疾病的新生兒。各組新生兒性別、分娩方式、體質量、胎齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經本院醫學倫理委員會批準。

表1 各組一般資料比較

1.2方法

1.2.1指標檢測 (1)出生后6 h內從新生兒的股靜脈采集血液標本，4 ℃下離心，分離血清，采用酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)檢測S100B和神經元特異性烯醇化酶(NSE)水平。(2)在新生兒出生后1 h內采集臍帶血，離心分離血清，采用Trizol試劑(美國，賽默飛世爾)從臍帶血中提取總RNA，使用miRNA RT-PCR試劑盒(日本，Takara)將其逆轉錄為cDNA；分別采用U6和GAPDH作為內參，采用SYBR Green Ⅰ Master Mix 試劑盒(美國，賽默飛世爾)檢測miR-499-5p、PTEN水平。miR-499-5p上游引物5′-GGCCGTTAAGACTTGCAGTG-3′，下游引物5′-GGGAAGCAGCACAGACTTG-3′，長度92 bp；PTEN上游引物5′-TGTGGTCTGCCAGCTAAAGG-3′，下引物5′-CGGCTGAGGGAACTCAAAGT-3′，長度94 bp;U6上游引物5′-CGAGCGCCACTTCAGAATA-3′，下游引物5′-CTCACGGCGCTTCATCAGAT-3′，長度139 bp；GAPDH上游引物5′-CGGATGCACCAATGTTCGTC-3′，下游引物5′-ACGCGTTGCTCACAATGTTC-3′，長度78 bp。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 25 s，75 ℃ 15 s，40個循環。 使用2-ΔΔCt法計算miR-499-5p、PTEN水平。

1.2.2新生兒行為神經測定(NBNA)評分 新生兒出生后第7天進行NBNA評分，包括主動能力、被動肌張力、主動肌張力、原始反射和一般評價5個部分，總分40分，NBNA評分<35分為異常。

1.2.3Gesell發育診斷量表評價 HIE新生兒在出生后40周和52周時采用Gesell發育診斷量表進行智能評價，并計算發展商數(DQ)。

2 結 果

2.1各組檢測指標及NBNA評分比較 HIE輕度、中度、重度組miR-499-5p水平、NBNA評分明顯低于對照組，PTEN、S100B、NSE水平明顯高于對照組，且隨著HIE嚴重程度的增加，miR-499-5p水平、NBNA評分逐漸下降，PTEN、S100B、NSE水平逐漸升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組檢測指標及NBNA評分比較

2.2miR-499-5p、PTEN、S100B、NSE診斷新生兒HIE的效能 miR-499-5p、PTEN、S100B、NSE單獨檢測診斷新生兒HIE的曲線下面積(AUC)分別為0.824、0.698、0.816、0.781；上述指標聯合檢測的AUC為0.896。

2.3miR-499-5p靶向PTEN的表達 Starbase在線軟件預測到miR-499-5p與PTEN存在結合位點chr10:89729614-89729621[+]，見圖1。

圖1 miR-499-5p靶向PTEN的表達

2.4各組DQ比較 HIE輕度、中度、重度組出生后40周、52周時的DQ明顯低于對照組，且隨著HIE嚴重程度的增加，新生兒出生后40周、52周時的DQ逐漸下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組40周、52周時的DQ比較

2.5DQ與miR-499-5p、PTEN、S100B、NSE水平的相關性分析 相關性分析結果顯示，HIE新生兒miR-499-5p水平與出生后40周、52周時的DQ呈正相關(P<0.05),PTEN、S100B 、NSE水平與出生后40周、52周時的DQ呈負相關(P<0.05)，見表4。

表4 DQ與miR-499-5p、PTEN、S100B、NSE水平的相關性分析

3 討 論

早期診斷、及時治療對于降低HIE新生兒神經系統后遺癥的發生率至關重要。S100B是一種膠質神經營養蛋白，主要位于膠質細胞和施萬細胞中，在星形膠質細胞的增殖、分化和神經系統病變中扮演著重要角色[9]。NSE是反映神經元損傷嚴重程度的生物標志物，神經元退行性病變、壞死或血腦屏障破壞時其水平顯著升高。NSE在HIE嚴重程度評估方面具有較高的準確性，還可以作為HIE診斷和預后判斷的生物標志物[10]。本研究中，HIE新生兒與健康新生兒比較，S100B、NSE水平明顯升高，且隨著HIE嚴重程度的增加，S100B、NSE水平逐漸升高，提示S100B、NSE與HIE的發生、發展有關。進一步評估S100B、NSE對HIE的診斷效能，結果顯示，AUC分別為0.816、0.781，具有一定價值。然而S100B、NSE水平升高也可以在其他疾病中被檢測到，包括新生兒感染性腦損傷。

研究發現，miR-499-5p在大鼠心肌梗死區域水平降低，同時在心力衰竭大鼠模型中其表達也明顯下調，miR-499-5p通過保護心肌細胞免受應激誘導的細胞凋亡而發揮心臟保護作用，通過靶向鈣調神經磷酸酶和動力蛋白相關蛋白-1減少細胞凋亡，從而減輕心肌梗死和心臟功能障礙的嚴重程度[11]。研究表明，miR-499在改善腦損傷后運動功能和神經功能方面發揮著一定作用[12]。PTEN位于人類19號染色體上，編碼一種使蛋白質去磷酸化的磷酸酶，對PI3K/Akt信號通路具有負調節作用，可調控缺氧缺血性損傷；此外，PTEN還可以調節血管生成，對于腦損傷的功能恢復有重要作用[8，13]。本研究中，HIE新生兒的miR-499-5p水平明顯低于健康新生兒，PTEN明顯高于健康新生兒，且隨著HIE嚴重程度的增加，miR-499-5p水平逐漸下降，PTEN水平逐漸升高，提示miR-499-5p、PTEN與HIE的發生、發展有關。進一步通過Starbase在線軟件預測到miR-499-5p與PTEN存在結合位點，miR-499-5p可能通過抑制PTEN水平，對HIE新生兒腦損傷起到保護作用。此外，本研究還發現，將NSE、S100B、miR-499-5p和 PTEN聯合檢測用于診斷HIE的效能最高，AUC為0.896，可用于HIE的臨床輔助診斷；同時，上述4項指標與HIE新生兒出生后40周、52周時的DQ具有相關性，提示其與HIE新生兒的智能發展有關，在預后評估方面可能也具有一定的價值，有待臨床深入研究。