敲低lncRNA SNHG7通過抑制ROCK1降低前列腺癌細胞增殖和遷移能力

佟麗斐，張霞，楊玉蝶，李起征，劉鵬

（大連醫科大學 1.附屬大連市第五人民醫院放療科，遼寧 大連 116021；2.附屬大連市第五人民醫院腫瘤內科，遼寧 大連 116021；3.附屬第一醫院腫瘤科，遼寧 大連 116011；4.附屬大連市中心醫院腫瘤內科，遼寧 大連 116033）

前列腺癌是一種危及生命的男性惡性腫瘤，2018年約新增130萬例，死亡35.9萬人［1］。盡管隨著診斷和治療的不斷進展，患者的生存時間極大延長，但部分高度惡性患者的5年總生存率仍很低［2］。因此，研究前列腺癌惡性發生、發展的分子機制，有助于臨床減緩甚至抑制前列腺癌的惡性進展。近年來，大量證據證實長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在前列腺癌中發揮關鍵作用［3-4］。lncRNA可以競爭性結合微RNA，或作為橋接分子與其他功能蛋白形成功能復合體，從而調控腫瘤生長、轉移過程關鍵基因的表達［3］。最近研究［5-7］發現，lncRNA小核仁RNA宿主基因7（small nucleolar RNA host gene 7，SNHG7）在多種腫瘤中呈異常高表達，而SNHG7異常高表達與乳腺癌、肺腺癌、膠質瘤的不良預后相關。盡管近期有研究［8］發現SNHG7在前列腺癌中高表達，但SNHG7在前列腺癌惡性進展中的功能仍有待進一步探索。

Rho關聯含卷曲螺旋蛋白激酶1（Rho-associated coiled-coil domain containing protein kinase 1，ROCK1）是轉化生長因子β/Smads信號通路調控因子，編碼一種蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，當與Rho的鳥苷三磷酸結合時將被激活［9］。前期研究［10］表明，ROCK1參與多種疾病的發病過程。此外，ROCK1在多種腫瘤的發病機制中發揮重要作用，激活ROCK1信號通路已被證實可促進胰腺癌細胞的侵襲和轉移［10］，ROCK1還可通過抑制PTEN/FAK通路促進非小細胞肺癌的發生、發展［11］。盡管已經在多種腫瘤中明確其作用，但ROCK1在前列腺癌中的具體調控機制尚不清楚。本研究通過Western blotting、Transwell實驗、熒光原位雜交實驗等深入探討SNHG7對前列腺癌細胞的惡性調節能力及可能機制，從而為前列腺癌的治療提供有效策略。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

人正常前列腺上皮細胞系RWPE、前列腺癌細胞系PC-3購自中國科學院上海分院，細胞培養于RPMI 1640培養基（北京賽默飛），并添加10%胎牛血清（美國Gemini Bio-Products）和100 U青霉素和鏈霉素雙抗（北京索萊寶）。VCaP和DU145細胞培養于DMEM培養基，并添加10%胎牛血清和100 U青霉素和鏈霉素雙抗。細胞于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2 轉染

使用Lipofectamine 3000試劑盒（美國Invitrogen）轉染SNHG7，根據說明書進行操作。SNHG7敲低質粒和ROCK1過表達質粒由上海吉瑪公司合成（si-NC和pcDNA3.1分別為敲低和過表達空白載體，即陰性對照組）。細胞生長融合度達到90%時進行傳代，傳代按照1 ∶3比例進行。待細胞生長鋪滿皿底50%左右進行轉染，轉染過程根據說明書添加Lipofectamine 3000和P3000，轉染后6 h換液，換液后24～48 h進行PCR檢測，48～72 h進行Western blotting。SNHG7敲低序列（si-SNHG7）：5’-GCUGGAAUAAA GAGUAACAUU-3’；陰性對照（si-NC）序列：5’-UU CUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。

1.3 MTT實驗

將5×103個細胞置于96孔板中，37 ℃培養。待細胞進行SNHG7轉染后，每孔加入10 μL MTT溶液，于37 ℃孵育4 h。在490 nm處測定各樣品的分光光度。所有實驗重復3次，計算平均值。

1.4 Transwell實驗

通過Transwell實驗（美國Costar）體外評估前列腺癌細胞的侵襲和遷移能力。細胞轉染后，將1×105個細胞接種于上室，并加入300 μL 培養基，下室加入等量培養基。48 h后擦除膜表面的細胞，使用甲醛固定20 min，隨后PBS清洗3遍，最后用0.5%結晶紫染色。在顯微鏡下隨機分為5個區，計數浸潤和遷移細胞數目。

1.5 總RNA提取和PCR

按照說明書使用TRIzol試劑分離總RNA。使用PrimeScript試劑盒（日本TaKaRa），根據說明書進行逆轉錄和實時PCR。使用SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ在Bio-Rad CFX 96實時PCR系統上進行實時PCR。GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法測定基因相對表達量。引物序列：SNHG7，正義5’-GTTGGGGTGTTGGCAT TCTTGTT-3’，反 義5’-GCGCCCAATACGACCAAAT C-3’；ROCK1，正 義5’-CTGCAACTGGAACTCAACC AAGAA-3’，反 義5’-TTAGCACGCAATTGCTCAATA TCAC-3’；GAPDH，正義5’-CGTCGCTAGCGATCGT TACA-3’，反義5’-CTAAATGCTAGTCTTTACGA-3’。

1.6 Western blotting

將SNHG7轉染后的前列腺癌細胞溶解于含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液。蛋白（20 μg）經過10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移到聚偏二乙烯膜上。使用針對ROCK1（中國CST公司）和GAPDH（中國CST公司）的一抗進行孵育，4 ℃過夜，翌日TBST清洗，每次5 min；隨后熒光二抗室溫孵育2 h（中國CST公司）。使用增強化學發光試劑進行發光成像（型號：FD8020，杭州富德生物科技有限公司）。

1.7 熒光原位雜交實驗

將細胞均勻鋪在6孔板中，使用4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗3次，每次5 min；隨后使用甘氨酸處理5 min，PBS再次沖洗5 min；使用0.5% Triton-100對細胞進行透膜10 min；PBS清洗3次，每次3 min；滴加雜交液預處理1 h，然后使用生物素標記的SNHG7探針（武漢塞維爾）進行細胞孵育，4 ℃過夜；抗生物素抗體（北京賽默飛）進行雜交過夜，最后滴加熒光二抗（北京CST），進行DAPI（北京碧云天）顯色。

1.8 統計學分析

采用GraphPad Prism 5軟件進行統計學分析。每個實驗重復3次，結果以表示。采用t檢驗進行2組間比較。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SNHG7在前列腺癌中高表達并提示預后不良

為了分析SNHG7在前列腺癌中的表達，首先通過癌癥基因組圖譜數據庫（http：//gepia.cancer-pku.cn）對其進行癌和癌旁組織表達差異分析。結果顯示，SNHG7在前列腺癌組織中高表達（圖1A）。此外，生存分析提示，高表達SNHG7與患者生存時間較短明顯相關（圖1B）。細胞學實驗發現，與人正常前列腺上皮細胞（RWPE）相比，前列腺癌細胞（PC-3、VCaP和DU145）中SNHG7明顯高表達（圖1C）。這些結果提示，SNHG7在前列腺癌的發生、發展中發揮重要的作用。

圖1 SNHG7在前列腺癌中高表達并提示預后不良Fig.1 SNHG7 is highly expressed in prostate cancer and indicates a poor prognosis

2.2 SNHG7主要位于細胞質

鑒于SNHG7在腫瘤組織和細胞中高表達，為進一步了解其功能和機制，通過熒光原位雜交實驗檢測SNHG7的亞細胞分布情況。結果提示，SNHG7主要位于細胞質。見圖2。

圖2 SNHG7主要位于細胞質中 ×400Fig.2 SNHG7 is mainly located in the cytoplasm ×400

2.3 敲低SNHG7抑制了前列腺癌細胞的增殖和遷移能力

為了進一步分析SNHG7的功能，構建SNHG7敲低細胞系。通過PCR對敲低細胞系進行SNHG7檢測（圖3A），結果顯示，成功構建了敲低細胞系。隨后使用SNHG7敲低細胞系進行MTT檢測，評估SNHG7對PC-3細胞增殖的影響，結果發現，其抑制了細胞增殖（圖3B）。Transwell遷移實驗也發現，其抑制了前列腺癌細胞遷移（圖3C）。這些結果提示，SNHG7在前列腺癌細胞的增殖和遷移中發揮重要作用。

圖3 敲低SNHG7可抑制前列腺癌細胞的增殖和遷移Fig.3 SNHG7 knockdown inhibits prostate cancer cell proliferation and migration

2.4 SNHG7調控ROCK1的表達

為了分析SNHG7能否通過ROCK1調節前列腺癌細胞的惡性進展，采用PCR檢測ROCK1的表達，結果發現，ROCK1在多種前列腺癌細胞中高表達（圖4A）。而當敲低SNHG7后，ROCK1mRNA表達減少（圖4B），蛋白表達減少（圖4C）。這說明SNHG7的對前列腺癌細胞惡性能力的調控可能是ROCK1介導的。

圖4 敲低SNHG7可抑制ROCK1的表達Fig.4 SNHG7 knockdown inhibited ROCK1 expression

2.5 SNHG7通過ROCK1調控前列腺癌細胞的增殖和遷移

進一步分析SNHG7與ROCK1及前列腺癌細胞增殖和遷移能力的關系，進行挽救實驗。首先構建ROCK1過表達細胞系，通過PCR（圖5A）和Western blotting（圖5B）檢測轉染后ROCK1的表達，結果證實，ROCK1過表達細胞系成功構建。隨后使用SNHG7敲低細胞系同時進行ROCK1敲低，結果發現，前列腺癌PC-3細胞的增殖（圖5C）和遷移能力（圖5D）恢復。以上結果表明，SNHG7通過ROCK1調控前列腺癌細胞的增殖和遷移。

圖5 SNHG7通過ROCK1調控前列腺癌細胞的增殖和遷移Fig.5 SNHG7 regulates prostate cancer cell proliferation and migration through ROCK1

3 討論

近幾十年來，lncRNA在疾病特別是癌癥中的重要作用越來越受到人們的關注。研究［12］已經發現，許多lncRNA作為癌基因或腫瘤抑制因子，可以調控前列腺癌的發生和轉移，但不同lncRNA在不同腫瘤中的作用尚不明確。lncRNA SNHG7是近年發現的新型非編碼RNA，多項研究［13］表明，lncRNA SNHG7在多種癌癥中過表達，包括肺癌、乳腺癌、結直腸癌和膀胱癌，通過多種途徑促進腫瘤的發生。最近有研究［14］報道了SNHG7加速前列腺癌的惡性進展，但SNHG7在其中的調節機制需要進一步探索。

本研究發現，與癌旁組織相比，lncRNA SNHG7在癌組織中明顯上調，并且SNHG7高表達提示患者生存時間縮短，體外細胞實驗同樣證明其在多種腫瘤細胞系中高表達。這些結果提示，SNHG7在前列腺癌的發生、發展中可能起到重要作用。為了闡明SNHG7異常高表達的意義，本研究通過細胞增殖實驗和Transwell實驗檢測細胞增殖和遷移能力，結果發現，SNHG7敲低后前列腺癌PC-3細胞的增殖和遷移能力都被抑制。近年發現ROCK1與多種腫瘤的生長和轉移密切相關，包括骨肉瘤、胰腺癌甚至血液系統腫瘤。ROCK1功能多樣化，廣泛參與多種細胞過程，包括凋亡、侵襲、纖維化等［15］。然而，SNHG7與ROCK1之間的調控關系尚不清楚。為此，本研究構建了SNHG7敲低前列腺癌細胞系，通過共轉染實驗發現，敲低SNHG7后ROCK1的表達明顯減少；并且通過MTT實驗和Transwell實驗發現，SNHG7敲低后細胞的增殖和遷移能力可被過表達ROCK1恢復。

綜上所述，SNHG7對于前列腺癌生長、轉移的調控是通過ROCK1介導的，以SNHG7或ROCK1為靶點的腫瘤治療方式可能成為治療前列腺癌的一種有效策略。