基于SSR 標記的廣東栽培益智群體遺傳多樣性分析

劉朝玉, 林艷, 吳保歡, 羊海軍, 李薇, 崔大方*

(1. 華南農業大學, a. 林學與風景園林學院; b. 基礎實驗與實踐訓練中心; c. 華南農業博物館，廣州 510462；2. 貴州省凱里市第一中學，貴州 凱里556000)

益智(Alpinia oxyphylla)為姜科(Zingiberaceae)山姜屬多年生草本植物，為中國特有種[1]，主產于海南、廣東、廣西、福建和云南。作為傳統中藥材，益智以成熟果實入藥，具暖腎固精、溫脾止瀉的功效，被譽為“四大南藥”之一[2-3]。隨著研究的深入，其新的藥用價值還在陸續發現，例如抗腫瘤和治療帕金森癥[4-5]。20 世紀80 年代以來，國內外市場對益智仁的需求逐漸增加，貨源已從野生資源采集轉化為規模化半野生人工栽培，年交易量達1 700~3 500 t[6]。生產方式的改變，促進了益智種質資源的收集、保存、評價和利用，以及優良品種選育、種苗繁育和規范化栽培等方面的研究，不僅更好地滿足消費需求，也保護了野生資源。

相對于化學成分、藥理藥效研究[7-8]，益智的種質資源評定、居群遺傳多樣性、優良品種選育等領域的研究尚處在初級階段[9]。Wang 等[10]利用ISSR(inter-simple sequence repeat)分子標記技術, 認為益智野生居群具有較高的遺傳多態性，建議通過禁止開發野生資源來保護該物種的棲息地，同時加強種質資源庫的建設。王茂媛等[11]的田間觀測表明，益智在花果形態方面存在極為豐富的多態性, 個體間差異明顯，但株叢內具有較高的一致性，其中果序長度、果實大小和形態這3 個性狀可作為鑒別益智種質資源及雜交育種評定的重要性狀。形態變異是基因型與環境壓力共同作用的結果，可在一定程度上反映生物遺傳變異的程度，然而王祝年等[12]報道益智種質資源間基于ISSR 標記的聚類與基于表型性狀的聚類結果不完全一致，一方面是表型性狀不僅受遺傳物質影響，也受海拔、經緯度、郁閉度等環境因子要素的影響[13]；另一方面，ISSR 具有通用隨機引物特征從而導致物種特性不強。相對的，SSR (simple sequence repeat)是在復制或修復過程中DNA 滑動和錯配或染色單體不均等交換的結果，具有較高的物種特異性，可用于鑒定雜合子和純合子[10,14]。SSR 長度為100~200 bp。因微衛星中重復單位的數目有極高的變異現象，所表現出的變異現象為微衛星單位數目成整倍性變異或可能出現重復單位序列中的序列不完全一樣，從而形成多態性位點。SSR 分子標記技術已成功應用于多種農林植物的遺傳多樣性分析、目標基因的標定和指紋圖譜的構建等研究中[14-16]。

20 世紀70 年代開始，廣東省從海南引種益智，至今種植面積已近4 000 hm2，其中茂名地區的信宜、高州最為集中連片[17-18]，由于益智良種選育工作嚴重滯后，以及農戶分散經營的業態，導致目前廣東省境內種植的益智種質十分混雜，形態變異多樣，產量差異顯著，抗逆性參差不齊[19-20]。本研究利用SSR 分子標記技術針對廣東省益智栽培群體進行遺傳多樣性的分析研究，探討其遺傳多樣性豐富度、遺傳結構及類型的劃分，為廣東省栽培益智種質資源的保護育種及良種選育提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

本試驗益智(Alpinia oxyphylla)材料分別采自廣東省茂名地區的信宜白石鎮岳龍村、洪冠鎮洪勝村，高州古丁鎮大窩村和龍馬村、深鎮鎮良坪村、新垌鎮高良村以及陽江市陽春雙滘鎮榕木村。根據益智果和葉片的形態特征分類劃分為10 個群體(Z1~Z8、DA 和YC)，共166 份材料(表1)。采集益智新鮮葉片，放入-80 ℃冰箱保存用于后續DNA 提取。

1.2 DNA 提取和測序

使用北京天根新型植物基因組DNA 提取試劑盒DP320 提取益智鮮葉片總DNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度檢測合格后稀釋至50 ng/μL，用于后續基因組測序。

1.3 SSR 引物擴增

23 對SSR 引物來自于鄒穎[21](表2)，經PCR 擴增選擇具有穩定擴增和多態性良好的14 對引物(表3)。SSR 擴增反應體系總體積為10μL，包括2×TaqPCR Master Mix 5μL，模板DNA 1μL (50 ng/μL), 上游引物0.1μL (100 ng/μL)，下游引物0.4μL (100 ng/μL),帶熒光的M13 引物0.4μL (100 ng/μL), ddH2O 3.1μL。擴增反應程序: 95 ℃預變性5 min；然后95 ℃變性45 s，52 ℃~62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環；最后72 ℃延伸20 min。

表2 SSR 引物序列Table 2 Sequence of SSR primers

表3 益智的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of Alpinia oxyphylla

1.4 SSR 數據分析

SSR 數據采用PopGene (ver. 1.32)[22]進行遺傳多樣性統計，計算Shannon’s 信息指數(Shannon’s information index,I)、等位基因數(observed number of alleles,Na)、有效等位基因數(effective number of alleles,Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、群體間基因流(Nm)和Nei’s 遺傳距離[23]。

利用Arlequin (ver. 3.5.1)分析群體間和群體內差異，位點和群體間的遺傳分化系數(Fst)，進行AMOVA 分子方差和顯著性分析，參數“Number of permutations”設置為9 999，“Number of permutetions”設置為100，顯著性水平設置為0.05[24]。利用Structure (ver. 2.3.4)軟件對群體進行遺傳結構分析,利用Structure Harvester 計算ΔK 值和LnP(D)值，計算群體最佳K 值[25]。采用R 軟件(www.r-project.org/)中ape 包的pcoa 函數進行PCoA 主坐標分析，并繪制樣本分布散點圖。

2 結果和分析

2.1 遺傳多樣性分析

SSR位點多態性從表3 可見，14 對引物在166 份栽培益智種質中共檢測出88 個等位基因，每對引物檢測等位基因1.198~3.279 個，平均3.729 個;Shannon’s 信息指數為0.190~1.235；觀測雜合度為0.090~0.696，平均0.448；期望雜合度為0.123~0.655,平均0.512。

群體遺傳多樣性比較采用PopGene 進行群體遺傳多樣性分析(表4)，群體間有效等位基因數最小為1.653 個，最大為4.023 個，平均2.599 個;平均每個群體可擴增出16.121 個個體，檢測到3.721個等位基因位點；Shannon’s 信息指數為0.520~1.463，均值為0.946；觀測雜合度和期望雜合度分別為0.328~0.683 和0.385~0.714，平均分別為0.448和0.512。其中，DA 群體的Shannon’s 信息指數最高，為1.463，等位基因數和有效等位基因數分別為6.000 和4.017，表明DA 群體的遺傳多樣性最為豐富。

表4 益智群體的遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity in Alpinia oxyphylla populations

群體遺傳分化分析從表5 可見，益智群體的遺傳分化系數Fst為0.043~0.265，平均為0.131，0.050≤Fst≤0.150 的有27 組，占比49.1%，0.150≤Fst≤0.250 的有15 組，占比27.3%，表明該益智種質大部分群體間處于中等偏高遺傳分化程度。Z4和Z5 群體的遺傳分化系數最高，為0.265，最低的是Z2 和Z3，為0.043。

表5 益智群體間的FstTable 5 Fst among Alpinia oxyphylla populations

AMOVA方差分析從表6 可見，在顯著性水平P<0.001 下，20.87%的遺傳變異發生在群體間,79.13%的遺傳變異發生在群體內，說明益智群體遺傳變異主要發生在群體內，群體間的遺傳分化較低。

表6 益智群體變異的AMOVA 分析Table 6 AMOVA variation analysis of Alpinia oxyphylla populations

2.2 群體遺傳結構分析

利用Structure 軟件基于貝葉斯數學模型對166份益智種質資源進行初步群體結構分析，結果表明，當K 值為4 時，模型的后驗概率最大(圖1) 由此可見，將供試益智樣本劃分為4 個類型最為合適(圖2)。從群體遺傳結構圖可以看出，群體Z2、Z3、Z4 和Z8 的遺傳背景較為相似，群體Z5、Z9、Z10較為獨立而各成一體，而群體Z1、Z6、Z7 存在一定的遺傳漸滲(圖2)。

圖1 不同K 值時ΔK 值的變化Fig. 1 Changes in ΔK at different K values

圖2 益智群體的遺傳結構圖。1~8: Z1~Z8; 9: DA; 10: YC。Fig. 2 Genetic structure map of Alpinia oxyphylla population. 1-8: Z1-Z8;9: DA; 10: YC.

PCoA 主坐標分析結果表明(圖3)，所有個體在二維空間上表現出集群分布特征，大致可分為4 個區, A 區主要包含來自Z1、Z2、Z3、Z4、Z7 和Z8群體的個體，B 區主要包含來自Z1、Z5 和Z6 群體的個體，C 和D 區則分別來自YC 和DA 群體。其中，C 區的植株形態為葉小、中果，種子較小; D 區的植株形態為葉大、中果，種子較大；A 區的植株形態葉較小、果實有大有小，種子有大有小；B 區的植株形態為葉大、果實為小果，種子有大有小, 各類群與表型特征之間未呈現出明顯關聯性。

圖3 主坐標分析圖Fig. 3 Principal coordinate analysis map

3 結論和討論

物種遺傳分化程度的高低受地理范圍、生態環境以及繁育系統等因素的影響[26-27]。Wright[28]首次將群體遺傳分化程度進行了劃分: 0≤Fst≤0.05 表示遺傳分化極小，可以不考慮遺傳分化; 0.05≤Fst≤0.15 表示處于中等水平；0.15≤Fst≤0.25 表示遺傳分化較大；Fst≥0.25 表示遺傳分化極大。本研究采用SSR 分子標記對166 份廣東產益智種質進行遺傳多樣性分析，廣東益智的遺傳分化系數為0.043~0.265, Shannon’s 指數均值為0.946，高于海南產野生種質的0.337 3[12]，表明廣東栽培的益智種質遺傳多樣性較高，遺傳背景更為復雜。

本研究在形態分類的基礎上對群體遺傳結構分析，可將166 份廣東益智種質分為4 大類群，基于PCoA 分析在二維空間上同樣表現出集群分布特征，但4 個區域的益智植株個體并沒有反映出形態特征的規律性，表現在基于分子標記的聚類結果出現較多的個體混雜現象，與基于形態的分類群體不能較好地實現一致性，可能的原因: 首先，益智主產海南，廣東后于海南開展益智栽培，很長時間里，農戶都自行從海南的不同地方分批引種，造成種源混雜，種質混亂的局面；其次，本研究所采用表型性狀僅包含果實，葉片性狀以及種子，而影響植物分類精確性的性狀多達幾十個[29]，因此性狀數量不足將會造成分類誤差，此外，植物表型性狀容易受到人為選擇和環境干擾的特性也會使分類結果產生誤差[30]；第三，引物數量影響分子標記準確性, 本研究所選用引物為14 對，引物不足會使覆蓋的基因組范圍受到限制，導致基因組信息顯示不全，從而對聚類結果產生影響。因此，后續研究應充分考慮多方面因素，提高植物形態分類和分子標記聚類的精確性。