FISH技術在生物冶金中的應用

王利沙 李平 趙洪俠

摘要：微生物種類在生物冶金的過程中具有重要的作用，但是傳統的培養方法已不能滿足于生物冶金研究的需要，隨著現代科學技術的發展，熒光原位雜交（FISH）技術被越來越廣泛的使用。FISH技術是一種不依賴于培養的微生物檢測技術，具有高度安全性和敏捷性，主要用來檢測礦中微生物的形態、數量和空間分布情況的一種現代分子生物學方法。本文主要介紹了熒光原位雜交（FISH）技術的原理、主要試劑、實驗儀器、浸礦菌的固定方法和原位雜交過程，同時對FISH技術在生物冶金中的應用和前景進行了展望。

關鍵詞：生物冶金 熒光原位雜交 環境微生物 浸礦菌

基金項目：基于FISH技術的細菌-硫鐵礦的吸附機制研究（項目編號：2021GX099）。

作者簡介：王利沙（1984—），女，碩士，主要從事教學工作。

李平（1978—），女，碩士，主要從事教學工作。

趙洪俠（1986—），女，碩士，主要從事教學工作。

Application of Fish Technology in Bioleaching

WANG Lisha ?LI Ping ?ZHAO Hongxia

（Weifang Nursing Vocational College， Weifang， Shandong Province， 261000，China）

Abstract： Microbial species play an important role in the process of bioleaching， but the traditional culture methods can not meet the needs of bioleaching research. With the development of modern science and technology， fluorescence in situ hybridization （FISH） technology is more and more widely used. FISH technology is a microbial detection technology independent of culture， with high safety and agility. It is mainly used to detect the morphology， quantity and spatial distribution of microorganisms in mines. This paper mainly introduces the principle， main reagents， experimental instruments， fixation method of ore leaching bacteria and in situ hybridization process of FISH technology are introduced. At the same time， the application and prospect of FISH technology in bioleaching are prospected.

Key Words： Bioleaching; fluorescence in situ hybridization （FISH）; environmental microorganism; leaching bacteria

生物冶金是利用微生物技術通過多種反應途徑對礦物進行氧化分解，再進行純化、富集、濃縮等，最終從礦物中浸出目標金屬的過程，也是涉及冶金、生物、礦物等多學科的一種微生物冶金技術。該技術具有以下優勢：反應溫和、工藝過程簡單、流程少、對環境友好、資源的利用率高等，因此被廣泛應用在濕法冶金、環境工程、礦物加工等領域。目前，微生物冶金技術也面臨著一些問題亟需解決，例如：微生物浸出過程的優化與控制，在極端條件下對浸礦菌株的高效選育、生物冶金領域的拓展等。傳統的微生物冶金研究方法，容易忽略生物間的相互作用和氣候變化的影響，所得出的試驗結果也不能真實的反映自然條件下微生物的空間分布、風度和生物多樣性等，因此具有很大的局限性，也限制了我們對浸礦菌株的開發和利用，因此亟需研究一種簡便的檢測方法，對浸礦微生物進行快速的鑒定和檢測。

現代分子生物學技術與傳統微生物學方法相比，能夠有效地促進和提高浸礦微生物的檢驗精確度和微生物的種類。隨著技術的發展，可以直接鑒定微生物的技術包括酶檢測技術、核酸探針檢測和免疫學檢測技術等，較為常用的分子生物技術包括限制性片段長度多態性分析技術（RFLP）、X射線光電子能譜分析（XPS）、變性梯度凝膠電泳（DGGE）、熒光定量PCR技術和熒光原位雜交技術（FISH）等。其中FISH是一種不依懶于培養的非放射性的微生物檢測技術，由于該技術具有安全、探針穩定、準確度和靈敏度高、雜交特異性好、能有多種顏色顯示等優點，可以更加直觀地檢測出微生物在礦物表面的數量和分布，因此近年來在環境微生物學、濕法冶金技術研究領域逐漸被廣泛使用。該文主要對FISH在檢測礦物中的微生物技術作以簡單介紹。

1 熒光原位雜交技術（FISH）簡介

FISH技術具有高度的靈敏性、準確的定位、比較短的試驗周期及較強的特異性;FISH采用的是熒光探針，比較的穩定且經濟;該技術采用高度靈敏度檢測儀器，如具有較高強度圖像的共焦激光掃描顯微鏡的使用，方便微生物計數的電荷耦合相機（CCD）和便于圖像數字化的圖像分析軟件，分析自動化的流式細胞儀等，增加了FISH技術的高靈敏度分析能力。

FISH技術是采用熒光標記的特異寡核苷酸序列作為探針，根據堿基互補配對原則，經過變性、退火、變性過程，探針與細胞內相應的靶RNA 分子或 DNA 分子的雜交，在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下通過觀察熒光的信號，來確定與特異探針雜交后微生物的形態、數量和分布。目前，FISH技術主要采用高度保守的16S rRNA來設計寡核苷酸探針，進而實現對相應菌株的原位檢測。采用rRNA來設計探針具有以下優勢：（1）16S rRNA在微生物體內具有很高的拷貝數，不同種類的微生物的相對序列保守型不同，進而設計特異性的探針，不同種、屬等水平上進行熒光檢測;（2）16S rRNA在微生物中分布廣泛且功能穩定，可以極大的提高檢測的靈敏性。

2 ?FISH技術的相關步驟

2.1主要試劑

（1）PBS緩沖液：30mM?NaCl、7 mM?NaHPO4、3 mM?NaHPO，調節pH 為7.2.

（2）4%多聚甲醇溶液：加熱的33mL高純水，2g多聚甲醇，16.5mL的PBS緩沖液，室溫條件冷卻后，調節溶液pH為7.2。

（3）明膠溶液：明膠，KCr（SO）﹒12HO。

（4）DAPI復染液：1 g DAPI和1 mL滅菌雙蒸水配成溶液，低溫下保存。

（5）雜交溶液：1M?pH8.0的?Tris/HCl ，5M的NaCl溶液，10%的SDS溶液，雙蒸水和甲酰胺。注意：配制雜交液的時候，要根據雜交液中甲酰胺的百分含量。

（6））洗脫液：1M?pH8.0的?Tris/HCl ，5M的NaCl溶液，10%的SDS溶液，0.5M?EDTA，雙蒸水。注意：洗脫溶液中的NaCl溶液的濃度隨著雜交液中的甲酰胺濃度而發生相應的變化。

2.2浸礦菌的固定

一般常用的固定方法為多聚甲醛固定法。取菌液100 mL，在4 ℃ 11 000 r/min離心8 min，棄上清液備用;再用滅過菌的PBS溶液洗滌菌液2次，棄去上清液后加入10 mL滅過菌的PBS溶液和30 mL 4%的多聚甲醛固定液制成菌體懸浮液，置于冰上固定3 h;4 ℃ 11 000 r/min離心8 min，棄上清液用30 mL滅過菌的PBS溶液洗滌、離心（11 000 r/min），再加入30 mL的PBS溶液和30 mL的在冰上預冷的乙醇制成菌體懸浮液;最后將處理好的菌體儲存在冰箱中（-20 ℃）備用。

2.3原位雜交

用移液槍吸取10 μL固定好的菌液加到經明膠處理好的載玻片上，室溫下晾干;依次用50%，80%和96%的乙醇溶液洗滌、脫水，空氣中干燥，再將配置好的雜交液滴在載玻片上，并蓋蓋玻片，于46 ℃進行雜交1.5～2.0 h;在黑暗條件下，用洗脫液進行洗滌，并用DAPI溶液對菌液進行復染，在室溫下晾干在熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡等進行顯色觀察浸礦菌的形態、數量及分布。

2.4 注意事項

（1）在原位雜交技術中，要設計合適的、便于觀察的探針，因為探針的特異性將會直接影響FISH技術的觀察結果。

（2）在處理微生物樣品的過程中，要進行規范操作，微生物的固定、消毒滅菌、黑暗操作條件等要嚴格處理，保證實驗結果的準確性。

（3）在用洗脫液對樣品進行洗脫處理的時候，一定要掌握好時間和尺度，防止出現假陽性或者假陰性，進而影響實驗結果。

3.1在環境微生物檢測中的應用

FISH技術不需要培養所檢測的微生物樣品，可以直接檢測樣品中的微生物

種類、分布，進而實現對自然條件下的微生物進行原位檢測，因此被官方應用于環境微生物學的研究中。主要表現在以下兩個方面：（1）FISH技術在污水生物凈化方面的應用。近年來，隨著我們對除磷、脫氮機理的深入研究，FISH技術的引入解決了污水生態系統的微生物的適時動態監測、脫氮細菌和除磷菌的培養難等問題。（2）在難降解有機物功能降解菌的研究。國內外許多學者采用FISH技術成功客服了功能降解菌培養難的問題，通過熒光（如FITC、Cy5等）標記特異性探針，監測反應器中的好癢顆粒物機內的微生物空間分布及種類。

3.2在醫學領域中的應用

由于FISH技術較高的敏感性和特異性，備受醫學領域的廣泛應用，能夠提早的發現腫瘤細胞，并及時的進行治療，大大提高了治療的成功率。例如：通過富集培養液基薄層細胞，并采用熒光原位雜交（FISH）技術來檢測尿路上皮癌具有重要的應用價值，為臨床醫生的正確診斷提供參考。

3.3在生物冶金領域的應用

FISH技術由于其自身的獨特優勢，除了在環境微生物、醫學領域之外，在生物冶金領域也備受青睞。例如：利用FISH技術和實時熒光定量PCR技術（Q-PCR）能夠快速且準確的檢測新疆鈾礦生物冶金中的細菌的數量、種類和空間定位，進而分析微生物群落結構的動態變化。采用FISH方法分析微生物與黃鐵礦的界面作用，通過專門設計Acidithiobacillus ferrooxidans和Leptospirillum ferrooxidans的熒光探針，檢測黃鐵礦表面細菌的吸附情況和空間分布。

4 ?FISH技術在生物冶金中的應用前景

近年來，隨著熒光原位雜交技術的高度特異性及其檢測結果的靈敏性，使得FISH檢測技術促使FISH技術在生物冶金領域、環境微生物學中被廣泛應用，也極大的擴展了生物冶金技術的研究空間。熒光原位雜交技術能夠彌補傳統的微生物培養技術的缺陷，還能客觀的反映微生物在實驗室或自然條件下的數量及空間分布等，對于生物冶金的研究奠定了理論基礎。

5 結語

盡管熒光原位雜交技術在生物冶金應用的過程中，會受到一些技術問題的困擾，例如：熒光信號弱、背景熒光強度高導致分辨率較低、對于生長緩慢的微生物細胞很難檢測等一系列問題，但是FISH技術可以聯合其他技術的應用，加上其高度的靈敏性，仍可以為微生物檢測提供更多的信息，被廣泛應用于環境微生物、濕法冶金等研究領域，對于深入、完整地進行生物冶金方面的理論研究具有重要的現實意義。

參考文獻

[1] 劉順亮.微生物浸礦技術的現狀及展望[J].江西化工，2017（5）：46-48.

[2] 郝福來.生物冶金技術的發展及其在黃金行業中的應用現狀[J].黃金，2019，40（5）：51-56.

[3] 魏嘉欣.生物冶金及其應用研究進展[J].江西化工，2020（3）：48-53.

[4] 宋偉鳳，李明聰，高崢.環境中微生物原位檢測方法研究進展[J].生物技術通報，2017，33（10）：26-32.

[5] 孫雅雯.西太平洋海山可培養細菌多樣性及新物種的分類鑒定[D].青島：青島科技大學，2018.

[6] 王丹陽.西太平洋卡羅琳海山可培養細菌的多樣性及2株海洋細菌新種的分類鑒定[D].青島：中國科學院大學（中國科學院海洋研究所），2018.

[7] 吳冬梅，薛正楷，周榮清.純培養微生物熒光原位雜交技術檢測的影響因素探究[J].中國釀造，2021，40（3）：96-100.

[8] MARKER D F， PEARCE T M. Homozygous Deletion of CDKN2A by Fluorescence in Situ Hybridization is Prognostic in Grade 4， But Not Grade 2 or 3， IDH-mutant Astrocytomas[J]. Acta neuropathologica Communications， 2020， 8（1） ： 169.

[9] 王新玲，王文君，張纓.液基薄層細胞制片在尿路上皮癌熒光原位雜交檢測中的臨床應用[J].腫瘤研究與臨床，2020，32（7）：507-509.

[10] 于苗苗. FISH和Q-PCR技術在生物地浸樣品分析中的應用[D].南昌：東華理工大學，2016.