腦創傷后AQP4在大鼠海馬的表達與MRI研究

艾 莉，魯 宏，林治華

(1.重慶市第七人民醫院， 重慶 400054； 2.重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054)

0 引言

創傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)具有高死亡率及高致殘率的特點，幸存者極易伴不同程度認知功能障礙[1]，這為患者及其家屬帶來嚴重的物質與精神負擔。造成這些后果的主要原因是TBI后繼發的腦水腫[2-3]，它主要由血腦屏障(brain blood barrier,BBB)受損導致的血管源性腦水腫和組織缺血、缺氧引發的細胞毒性腦水腫組成，腦水腫的發生、發展嚴重影響神經細胞功能恢復與預后[4-7]。通過臨床觀察發現，腦創傷患者大部分會出現認知功能減退及記憶力下降。這種功能的異常改變與腦創傷后腦水腫的發生部位是否有關聯，其產生的病理分子機制亟待深入研究。海馬位于內側顳葉，是大腦負責認知與記憶功能的重要結構[8]，在多種中樞神經系統疾病的預后中發揮著重要作用。TBI后患者出現不同程度的認知功能障礙是否與海馬組織水腫相關，其病理分子機制尚不明確。因此，對TBI后認知功能障礙是否與海馬部位的水腫相關和其產生的病理分子機制進行研究，有助于為腦創傷的機制研究與基因藥物開發奠定理論基礎。

AQP4是腦內分布最多的水通道蛋白，主要分布于星形膠質細胞、室管膜上皮細胞、脈絡叢上皮細胞、血管內皮細胞等支持細胞中，在腦水腫形成發展中起著關鍵作用[9-14]。研究顯示，AQP4的表達上調與細胞內水腫關系密切[15]，通過基因沉默AQP4可顯著減輕細胞內水腫的嚴重程度[10,16-17]。腦創傷后，AQP4是否參與海馬組織水腫的病理過程，目前尚無實驗依據。

本研究通過建立大鼠腦創傷模型，應用MRI技術對大鼠海馬水腫進行定性及定量分析，HE染色觀察了大鼠海馬部位組織水腫的情況，AQP4/GFAP雙標免疫熒光染色檢測AQP4在海馬部位的極性分布，qPCR檢測海馬部位AQP4 mRNA的表達，并對比了其創傷側與非創傷側的差異，探索TBI后AQP4在海馬組織中的表達以及AQP4與海馬組織水腫的相關性，觀察TBI后海馬組織的MRI征象變化，以期為腦創傷的機制研究與基因藥物開發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用成年雄性Wistar大鼠50只，購于陸軍軍醫大學大坪醫院實驗動物中心(動物使用許可證號：SYXK(軍)2012-0037；動物生產許可證號：SYXK(軍)2012-0012)，250～300 g，12 h亮12 h暗，溫度控制在22～25 ℃,自由攝取水和食物。根據實驗目的將50只大鼠按隨機數字表分為對照組(n=10)、創傷組(n=40)；創傷組再根據不同時間點分為1、6、24、72 h 4個亞組，每亞組各10只(對照組除外)。每組取6只大鼠行7.0 T多模態磁共振掃描，掃描結束后將大鼠用于qPCR檢測雙側海馬部位腦組織AQP4的表達，從余下4只大鼠中分別取2只用于病理(HE染色)觀察，2只用于激光共聚焦觀察AQP4的表達部位。

1.2 建立腦創傷動物模型

采用改良的Feency氏法[8]用PinPointTM顱腦損傷撞擊器(美國Hatteras公司)制作腦創傷模型。用1.5 g/L戊巴比妥鈉按50 mL/kg對大鼠行腹腔注射麻醉。俯臥位將大鼠頭部固定于立體定位頭架(ST-7Setagaya-Ku，日本Tokyo公司)上，頭部備皮，常規消毒，沿正中線切開頭皮約2 cm。應用牙科臺式電鉆機1.5 mm鉆頭(轉速4 000 r/min)于前后囟之間、中線右旁開2.5 cm處鉆開顱骨，以此為中心用蚊式血管鉗打開直徑為5 mm的圓形骨窗，保持硬腦膜完整，對準骨窗撞擊，建立右側大腦中度腦創傷模型，根據預實驗選擇參數：撞擊速度2.5 m/s，撞擊深度3.5 mm，撞擊時間0.85 s，撞擊頭直徑4 mm，創傷灶兼有皮髓質損傷，骨蠟封閉骨窗，局部止血后縫合頭皮。對照組除不撞擊之外，其他操作同創傷組。

1.3 MRI檢查

每組6只大鼠，用異氟烷(Aerrane,百特國際有限公司)麻醉后置入維普特V-1動物麻醉機(Vetequip,USA)內行7.0 T多模態MRI掃描，采用BRUKER 7.0 T小動物MRI掃描儀(BRUKER，GERMANY)，大鼠仰臥位置于專用相控陣實驗動物線圈。以視交叉為中心掃描。掃描參數：Localizer:TR 100 ms，TE 3 ms，層厚1 mm，間距0 mm,視野40 mm×40 mm，矩陣256×256。T2WI：TR 4 000 ms，TE 35 ms，層厚1 mm，間距0 mm,視野35 mm×35 mm，矩陣256×256。DWI：TR 3 000 ms，TE 22 ms，層厚1 mm，間距0 mm,視野35 mm×35 mm,矩陣128×128,分別選用b值為0、1 000 s/mm2進行成像。掃描結束后，將所得圖像傳送到后處理工作站,測量雙側海馬的ADC值，依據公式：ADC(mm2/s)=In(S1/S0)/(b0-b1)，S1為b=1 000的信號強度，S0為b=0的信號強度，In為自然對數。

1.4 病理觀察與海馬定位

獲取大鼠大腦組織進行石蠟包埋切片脫蠟，再用蘇木素染3～8 min，自來水沖洗，1%的鹽酸酒精分化數秒，自來水沖洗，0.6%氨水返藍，流動水沖洗。再伊紅染色3 min，最后脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察雙側海馬病理改變，并進行圖像采集。

1.5 腦組織切片AQP4/GFAP雙標免疫熒光染色檢測AQP4在海馬中的表達

取損傷區的大腦切片組織，常規進行石蠟包埋和切片。將石蠟切片處理后加正常山羊血清封閉,滴加一抗(兔抗大鼠AQP4-IgG 1∶300和小鼠抗大鼠GFAP-IgG 1∶300)50 μL，4 ℃過夜,37 ℃復溫,PBS沖洗后，滴加二抗(羊抗兔IgG-cy3(18) 1∶200和羊抗小鼠IgG- 488(11)1∶100)40～50 μL，處理后滴加DAPI封片，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察并攝片。

1.6 qPCR檢測AQP4相對表達量

總RNA提取：每30 mg組織中加入500 μL,勻漿后加入三氯甲烷，立即顛倒混勻，靜置3 min，4 ℃ 12 000 g離心10 min，吸取上清，加入等體積的異丙醇，立即輕輕混勻10次，-20 ℃放置20 min，4 ℃ 12 000 g離心10 min，留沉淀，采用75%乙醇洗沉淀2次，最后棄上清，待乙醇揮發干凈，加入50 μL無菌水溶解沉淀。采用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA，染料法熒光定量PCR檢測AQP4的mRNA相對表達量。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 TBI后MRI顯示海馬組織發生水腫

本研究將實驗動物分為對照組和創傷組，其中創傷組又根據不同時間點分為創傷后1、6、24、72 h 4個亞組，通過MRI檢查發現：① 對照組：DWI及ADC圖未見明顯異常(圖1(a)，1(b))；② 創傷組創傷側海馬：創傷后6 h，DWI開始出現高信號(圖1(c))，并一直持續至創傷后72 h(圖1(d))；與對照組相比，ADC值在創傷后6 h出現明顯下降，創傷后24 h達到最低(P<0.05)，隨后開始升高，創傷后72 h恢復至正常(表1)；③ 創傷組非創傷側海馬：DWI在創傷后1、72 h未見明顯異常，創傷后6、24 h呈高信號；與對照組相比，ADC值在創傷后6 h輕微下降(圖1(e))，創傷后24 h明顯下降(圖1(f)，P<0.05)，隨后開始升高，創傷后72 h恢復至正常(表1)。

2.2 TBI后創傷側海馬膠質細胞及顆粒細胞存在明顯的細胞內水腫

通過將對照組與創傷后各亞組分別進行HE染色觀察海馬水腫情況。對照組雙側海馬膠質細胞及顆粒細胞形態分布正常，毛細血管較少，未見明顯細胞內水腫及血管源性水腫(圖2(a))。創傷組創傷側：在創傷后1 h，海馬膠質細胞及顆粒細胞形態分布未見明顯異常，毛細血管形態正常；創傷后6 h，可見膠質細胞及顆粒細胞輕度腫脹，胞漿淡染，表現為細胞內水腫，血管內皮周邊亦可見水腫，間隙模糊，但此時以細胞內水腫明顯(圖2(b))；創傷后24 h，細胞腫脹程度以及血管周邊水腫明顯加重，病理表現為混合性水腫，但仍以細胞內水腫為主(圖2(b))；創傷后72 h，2種水腫明顯減輕，尤以細胞內水腫變化為著(圖2(b))。創傷組非創傷側：創傷后1、72 h未見明顯病理變化(圖2(c))；創傷后6 h及24 h可見海馬膠質細胞及顆粒細胞水腫，少許血管內膜水腫(圖2(c))。

2.3 TBI后未發現海馬細胞存在AQP4的明顯表達

建立大鼠腦創傷模型，選擇創傷后6、24 h作為檢測時間點，采用免疫熒光染色檢測AQP4在海馬中的表達，利用GFAP標記星形膠質細胞。對照組雙側海馬膠質細胞及顆粒細胞形態分布正常，均未見明顯AQP4(紅色)表達(圖3(a))；創傷組創傷后6 h(圖3(b))和24 h組(圖3(c))亦未見明顯的AQP4表達。

圖2 HE染色顯示TBI后海馬部位顯微鏡下 病理改變(HE×400)

紅色為AQP4,綠色為GFAP

2.4 TBI后海馬組織中AQP4的mRNA沒有明顯變化

本研究采用qPCR檢測創傷后6 h和24 h海馬組織中AQP4 mRNA的表達。結果同圖3，與對照組相比，創傷后6 h和24 h組均未見明顯的AQP4表達水平升高(圖4，P>0.05)。

ns：TBI 6、24 h后創傷側和非創傷側分別與sham相比沒有統計學差異，P>0.05)

3 討論

1) 本研究按照改良Feency氏法構建腦創傷模型，由于多模態MRI技術中，DWI與ADC值結合能準確反映腦水腫情況及判斷腦水腫類型[18]，通過MRI技術對實驗動物大腦水腫信號的分析，發現：① 創傷后海馬的創傷側與非創傷側在MRI上都出現了水腫，且水腫類型以細胞內水腫為主，這與病理觀察結果一致；② 海馬水腫出現時間(創傷側TBI后6 h，非創傷側TBI后24 h)均遲于腦損傷皮質區(腦皮質區TBI后1 h即出現，以血管源性水腫為主)。TBI引起海馬水腫的具體機制尚不清楚。大量實驗證明AQP4在腦水腫的形成中發揮了重要作用，且呈雙向性，既可加重腦水腫，亦可減輕腦水腫。推測AQP4參與了海馬組織水腫的產生與發展。

2) 為了明確AQP4是否參與了TBI所致的海馬組織水腫，本研究通過AQP4/GFAP雙標免疫熒光染色檢測AQP4在海馬部位的極性分布以及qPCR檢測海馬部位AQP4 mRNA的表達。AQP4/GFAP雙標免疫熒光染色檢測發現，對照組及TBI組大鼠海馬部位星形膠質細胞大量分布，但未檢測到AQP4的明顯表達；而qPCR檢測亦未在對照組和TBI組中檢測出AQP4 mRNA的表達，兩者結果一致。但本實驗中通過HE染色可見TBI后6 h和24 h海馬組織明顯細胞內水腫。由此推測TBI所致的海馬組織水腫可能不是由AQP4主要介導的。腦水腫常常是血管源性水腫和細胞毒性水腫同時存在，只是在不同情況下以某一種水腫占主導。有學者認為AQP4是產生血管源性水腫的原因[19-20]；同時也有報道認為AQP4是血管源性水腫的結果[21]。本實驗中未檢測到明顯AQP4的表達，可能是選取的檢測時間點不夠，也可能是AQP4本身就不是TBI后海馬組織水腫形成與發展的主導者。劉輝等[22]的研究結果顯示，腦外傷后幾乎所有時段，雙側海馬AQP4的表達在對照組和創傷組中均無顯著差異，與本實驗結果相符；但也有研究[23]顯示，創傷后1 h，大鼠海馬 AQP4 在蛋白質水平上的表達開始升高，并一直持續至創傷后15 d恢復至正常，且腦含水量的增加與HIF-1及AQP4呈正相關。2種觀點之所以不同，可能與實驗方法不同有關。而且從后一觀點可看出，大鼠海馬組織水腫與血腦屏障通透性密切相關，這是因為HIF-1是調控血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的關鍵因子，而后者又是血管的生理功能及血管生成的主要調節因子。除此之外，腦創傷后AQP4表達的升高，不排除是機體保護機制或其他因素(如VEGF)所致。由此可見，TBI后大鼠海馬組織水腫可能是多因素的共同作用所致，而AQP4或許只是其中的“配角”或中間者。

3)本實驗中發現TBI后AQP4未在海馬組織中明顯表達，究其原因，主要有以下幾個方面：① 極性分布的影響：有研究發現，穹窿下器官、海馬等部位缺乏血腦屏障，AQP4直接表達在這些部位的星形膠質細胞胞膜上，而非表達在終足膜[22]，提示這些特殊部位 AQP4 不呈極性表達，這與本研究的結果相符。在本研究中，影像學、病理學都可觀察到創傷組大鼠大腦海馬的明顯水腫，且創傷側較非創傷側更重，可見腦創傷大鼠海馬存在水腫，但AQP4表達無顯著差異，可能是海馬缺乏血腦屏障，AQP4無極性表達所致。② 創傷后海馬水腫可能存在其他分子機制：腦創傷后海馬的水腫可能不由AQP4主導，而是由其他分子機制介導，如同屬水通道蛋白家族的AQP1、基質金屬蛋白酶、VEGF、緊密連接蛋白、炎性細胞因子及炎性反應、補體系統等也參與了腦水腫的發生發展[23]；亦可能是AQP4通過激活某些細胞(如星形膠質細胞)促進介質的釋放導致腦水腫。海馬的水腫具體由哪些機制介導，尚需進一步研究。③ AQP4的極性轉換：本課題組的既往研究證實，創傷早期，由于BBB破壞導致血管源性水腫出現，AQP4表達稍微下調；創傷后12 h， AQP4表達明顯上調，致使細胞內水腫程度加重；創傷后48 h，血管源性水腫再次加重(提示血腦屏障2次開放)，此時AQP4表達有所下降；創傷后72 h，AQP4表達上調與細胞內水腫的加重一致；創傷后7 d，2種水腫均下降至基線水平；AQP4的表達下調是血管源性水腫的結果，AQP4的上調是細胞內水腫的原因。AQP4通常在膠質細胞終足膜上極性表達，極性反轉后，先在胞漿中彌散表達，之后在細胞膜上表達[24]，得出AQP4在海馬組織中非極性表達。邱國平[25]的研究表明，在海馬等AQP4非極性表達的特殊部位，腦出血后，AQP4與β-DG的表達沒有明顯變化，推測其原因可能與AQP4的非極性表達不受腦出血后病理生理改變的影響有關，也可能非終足膜上表達的AQP4是通過其他某些分子定位，而非β-DG，但具體機制尚不清楚，需要進一步深入研究。

4 結論

通過建立大鼠腦創傷模型，聯合應用影像學及病理學方法，得出結論：與對照組相比，創傷組海馬明顯水腫，且創傷側較非創傷側更嚴重。在AQP4非極性表達的海馬腦創傷后，AQP4在星形膠質細胞的表達沒有明顯變化，推測其原因與AQP4的非極性表達不受腦創傷后病理生理改變的影響或AQP4表達隨時間推移、極性反轉的動態改變有關，也可能是由于海馬的腦水腫由其他分子機制介導，而非AQP4主導。本研究可為進一步探究腦創傷后腦水腫的發病機制及可能的基因治療方案提供參考。