CRISPR/Cas9基因編輯技術在植物病原真菌中的應用研究進展

夏雄飛 潘俊良 韓長志

摘要：CRISPR/Cas9是在細菌、古細菌基因組中含有的一種成簇有規律的間隔短回文重復序列，該結構被其用于抵御外來微生物基因入侵。通過對上述結構進行改裝從而形成一種基因編輯方法，與傳統的鋅指核酶和轉錄激活因子樣效應物核酶基因編輯方法相比，CRISPR/Cas9基因編輯技術具有更高效的優勢。本文以CRISPR/Cas9系統的組成、作用機制和運用原理為切入點，系統總結了該技術在植物病原真菌（稻瘟病菌、橡膠樹膠孢炭疽菌、玉米黑粉病菌等）中的致病相關基因組定點編輯應用情況，明確了當前在植物病原真菌中應用CRISPR/Cas9系統的編輯效率整體較低，不同sgRNA設計工具、目的等對編輯效率、靶向特異性的潛在影響，以及宏觀突變檢驗方式的偏差問題等局限性，并提出了該系統應用范圍的擴大、編輯效率的提高以及新型編輯方式的挖掘等建議與展望。

關鍵詞：CRISPR/Cas9;植物病原真菌;基因編輯;研究綜述

中圖分類號： S432.4+4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）12-0022-06

收稿日期：2021-09-03

基金項目：國家自然科學基金（編號：31960314）;云南省“興滇英才支持計劃”青年人才專項（編號：YNWR-QNBJ-2020-188）;云南省應用基礎研究計劃（編號：2018FG001-028）。

作者簡介：夏雄飛（1996—），男，安徽合肥人，碩士研究生，主要從事資源利用與植物保護研究，E-mail：616385792@qq.com;共同第一作者：潘俊良（1988—），男，上海人，碩士研究生，主要從事資源利用與植物保護研究，E-mail：panjunliang@sh.chinamobile.com。

通信作者：韓長志，博士，教授，主要從事經濟林木病害生物防治與真菌分子生物學研究。E-mail：hanchangzhi2010@163.com。

目前，CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9）基因編輯技術在實現對植物、動物以及微生物等特定基因條件性敲除、敲入、替換、修復等方面具有較為廣泛的應用，彌補了鋅指核酸內切酶（ZFNs）和類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALENs）等傳統編輯技術的劣勢[1]。該技術具有設計過程簡單、同時多位點編輯等優點[2]，可廣泛應用于醫藥、農業及工業等領域，目前在構建動物、細胞系模型以及癌癥治療[3]、良種育種[4]以及工業微生物改造[5]等方面已經得到了實踐驗證。2020年10月，法國科學家埃瑪紐埃爾·沙爾龐捷和美國科學家珍妮弗·杜德納以CRISPR/Cas9技術開發者身份獲得諾貝爾化學獎[6-7]。植物病原真菌對農林業造成重要危害，對社會、經濟等各方面產生重大影響。前人對于病原真菌的基因研究，多采用單基因敲除的方式以挖掘新的致病基因，由于某些真菌發生同源重組效率較低，缺乏啟動子和有效的轉化子篩選標記以及相對復雜的遺傳性，嚴重影響致病機制的解析[8]。當前學術界對于真菌基因編輯的綜合分析多集中于工業絲狀真菌以及食藥用大型真菌等，然而尚未見對該技術在植物病原真菌中的應用進行對比分析，本文以稻瘟菌、橡膠樹膠孢炭疽菌、玉米黑粉菌、鏈格孢霉、小球腔菌、鐮刀菌等6種病原真菌為例，對前人所開展的CRISPR技術相關應用展開綜述，并對其研究思路、方法、內容、結果以及對后續相關研究的影響等展開解析，以期為進一步開展該領域的科學研究提供重要的理論指導。

1 CRISPR/Cas9系統基本原理

CRISPR/Cas9基因序列主要由Cas9、前導序列、間隔序列、前間隔序列臨近基序（PAM）以及重復序列組成。單鏈向導（sgRNA）源自于間隔序列的轉錄加工，由于sgRNA的部分母DNA來自外源基因，所以其能夠與目標外源基因上源間隔序列特異性互補配對。sgRNA通過識別PAM并引導Cas9復合體與目標基因特異性結合并剪切[9]。基于此原理，人工設計出一種可識別并靶向設計者意向基因的sgRNA，同時將sgRNA和Cas9進行定向優化，諸如添加核定位序列（NLS）、核酶序列等以提高編輯效率[10-11]，sgRNA將引導Cas9準確剪切目標基因，基因的刪除激發了細胞內DNA的同源修復（HDR）或非同源末端連接（NHEJ）修復。對于HDR途徑，能夠較準確地替換部分目標基因，但外源序列要與目標序列具有高同源性才能實行HDR;對于NHEJ途徑，其雙鏈斷裂的位置則會發生隨機的插入或刪除（圖1）。

2 CRISPR/Cas9系統在植物病原真菌中的應用

2.1 稻瘟菌

稻瘟菌引起的稻瘟病是水稻種植最主要的威脅，在我國發病水稻面積每年高達380萬hm2，產量損失占到總產量的10%～30%[12]。Arazoe等最先對稻瘟菌建立了CRISPR系統，成功阻斷了小柱孢酮脫水酶基因（SDH）的表達，并發現了利用U6啟動子編輯效率相比TrpC啟動子更高[13]。盡管總體效率偏低，且突變體DNA無法穩定自我復制[14]，但為該系統在稻瘟菌中的運用奠定了基礎。為了解決上述問題，Foster等在前人研究基礎上進一步設計出了應對稻瘟菌的RNP-CRISPR-Cas9編輯系統，結果顯示靶向ALB1基因的效率均大于50%，產生70%～80%的轉化子。此外，他們還開發了一種“共同編輯”策略，即將2個獨立的RNP核糖核蛋白（Cas9-NLS-sgRNA）一起轉化至稻瘟菌，一部分細胞會同時占據2個RNP并被編輯2處，如果其中一個基因具有易于觀察的表型，即可用作選擇標記篩選轉化子，然后確定第2個基因是否也被編輯，該方法在最大程度上避免了脫靶，但效率僅有0.5%～2.0%，在后續研究中可以嘗試通過轉化方式替換或調整RNP與供體DNA比例進行優化（表1）[15]。2019年，Yamato等開發了單交叉介導的同源重組編輯策略，即轉化載體中包含1個在CRISPR/Cas9切割位點的單同源臂，高效實現了稻瘟菌中SDH的替換與GFP基因的敲入，并且利用該策略驗證了Spo11基因的功能和表達[16]。

2.2 橡膠樹膠孢炭疽菌

橡膠樹膠孢炭疽菌可侵染橡膠樹苗期、幼樹直至成熟階段，嚴重影響膠乳產量[17]。在廣東紅五月農場、海南瓊海和瓊山橡膠林等地曾大面積暴發[18]。郭燕華等對該菌建立了的CRISPR/Cas9系統，通過ChopChop[19]軟件預測靶標基因URA5中的sgRNA切割點，再將體外表達出含Cas9的RNP與sgRNA融合成復合體轉化至該菌中，結果在HDR與NHEJ條件下均成功獲得了敲除突變株ΔURA5，表現為尿嘧啶缺陷[20]，其中HDR相比NHEJ能夠在基因編輯過程中實現雙突變[21]，應用場景更廣闊。2019年，Nakamura等首次利用3種CRISPR/Cas9系統對炭疽菌的SCD1進行了基因替換，首先利用質粒轉化的方式，效率高達97.1%;其次利用Cas9/sgRNA復合物轉化，效率達到82.1%;最后同時利用Cas9和sgRNA表達質粒進行雜交轉化，效率為89.2%，此外還用該方式對NIS1、Cel5A、g9136、MC96基因進行了編輯，除MC96效率僅有50%外，其余均達到理想效率，并且驗證了該雜交轉化體系可減少脫靶與DNA損傷反應現象[22]。

2.3 玉米黑粉菌

玉米黑粉菌引起谷物黑穗病，在我國黃淮海周邊、東北地區發病現象普遍[23]。Schuster等利用CRISPR/Cas9技術靶向了該菌中的bE1和bW2基因，在Cas9中添加了2個NLS和HA標簽以組成NLS-Cas9-HA-NLS復合物，并將其置于具有萎銹靈抗性的質粒pMS7中，在不添加DNA供體的情況下將pMS7轉化至該菌，通過菌株的Fuz表型（是否為菌絲體）評估，結果獲得的突變株在單個轉化子的子代中高達70%～100%，2個目標基因的編輯效率差異較大。最后在缺乏萎銹靈的培養基中篩選，具萎銹靈抗性的轉化子可以將pMS7丟棄，解決了單個突變體后代多異質的問題[24]。2019年，Huck等成功構建了靶向稗黑粉菌malA基因（編碼蘋果酸酶）的CRISPR/Cas9系統，利用短DNA修復模板在Cas9剪切靶標序列后誘導HDR的基礎上對目標基因進行特殊的修飾，該方法為后續構建基于NHEJ且無標記的高效突變體系奠定了基礎[25]。2021年，Wege等基于CRISPR/Cas9技術并利用高濃縮的短雙鏈寡核苷酸誘導HDR成功靶向了玉米黑粉菌中編碼細胞分裂所需的don3基因，包括敲除、替換、基因組位點異源互補以及內源性熒光蛋白標記等試驗，彌補了玉米黑粉菌需要長同源序列才能產生基因缺失的局限性[26]。

2.4 鏈格孢霉

鏈格孢霉可引起果樹、蔬菜等植物病害[30]。Wenderoth等通過改造構巢曲霉的CRISPR系統，靶向了鏈格孢霉黑色素合成過程中聚酮化合物合酶基因pksA和1，3，8-THN還原酶基因brm2，在sgRNA兩端分別安裝了不同的核酶，通過原生質體介導的方式將質粒導入該菌，結果有1/10概率表現出缺乏黑色素的表型，為了產生穩定突變株，再以單孢子菌落在不同培養基上多次再生純化，從而使得轉化質粒丟失，體現出了該方式可連續誘變靶基因以及在無選擇壓力情況下自我復制質粒可丟失的優勢，有利于無性物種進行遺傳育種。此外，首次在該菌的基因編輯中引入綠色熒光蛋白（GFP），將GFP的C端添加NLS以保證其特異性，結果顯示14個尿嘧啶轉化子中有9個表型發光，證實了GFP利用的可行性[27，31]。2019年，他們再次利用CRISPR技術致使該菌中多個合成基因失活，并在米曲霉中外源表達來自鏈格孢霉的聚酮化合物（AOH）及其衍生物單甲醚（AME）基因，鑒定了AOH與AME的合成基因簇pksl，并進一步通過pksl基因簇的缺失突變體毒力降低現象驗證了AOH與AME是鏈格孢霉的毒力因子之一[32]。

2.5 小球腔菌

小球腔菌可使十字花科植物患上黑脛病，造成產量、品質下降[33]。Idnurm等針對小球腔菌設計CRISPR/Cas9系統進行了2次嘗試。第1次成功靶向了hos1基因（編碼組氨酸激酶），先后轉化sgRNA、Cas9至該菌，最后利用KpnⅠ限制酶測序，結果顯示小球腔菌在hos1基因區域均有突變，但通過接種發現其致病性依然存在。第2次成功靶向了AvrLm1無毒基因，將一個HDV核酶綁定于sgRNA，另一個錘頭狀核酶與sgRNA的折疊區域被合成為含有101個核苷酸的寡核苷酸，減小了構建體大小以便轉化，結果除了目標位點的突變外，其等位基因還發生額外的堿基對缺失[28]。2020年，Zou等利用CRISPR/Cas9系統對該菌中AvrLm1進行突變，在無抗性選擇標記的情況下鑒定其編輯效率在單個轉化子的子代中達到32%，該基因突變導致H2O2產生不同水平積累，從而對具有相應抗性基因Rlm7的甘藍型油菜表現出不同毒力效果，進一步利用突變株毒性進行抗性測定，將得到的具抗株用以選育或鑒定甘藍型油菜中新型Rlm7[34]。Darma等首次鑒定出該菌中包含類脫落酸合成基因簇pks5，并基于CRISPR/Cas9技術對該基因進行毒性測定，其中2個基因與其對油菜子葉的致病性無直接關聯[35]。

2.6 鐮刀菌

鐮刀菌可引起小麥、玉米、水稻等經濟植物患病，是全球最常見的植物病原真菌之一[36]。Ferrara等基于CRISPR/Cas9工具，對該菌中FUM1基因進行編輯，利用微同源重組的方式，即發生在目標位點相鄰序列的兩側同源50 bp內的HDR，極大地降低了突變鄰近基因的風險并且具有能靶向緊密間隔基因的優點，與常規重組相比，進一步增加了靶向精確性，同時也能降低脫靶風險。結果獲得了11個ΔFUM1轉化子，并且在表型都沒有產生明顯變化的前提下，轉化子均未檢測出伏馬菌素。該研究首次使用CRISPR/Cas9系統刪除了霉菌毒素合成途徑中的pks基因，并證實該系統可用于靶向其近親物種藤倉鐮孢菌等[29]。Wang等針對尖孢鐮刀菌體于外組裝了包含Cas9、sgRNA的RNP復合體并轉入其原生質體，進行PEG（細胞融合劑）介導的基因編輯，成功突變了該菌次級代謝產物合成基因簇中聚酮合酶的BIK1同源基因，雖然效率僅有50%，但證實了該基因參與紅色素比卡菌素的合成[37]。2019年，該團隊基于獨立的同源靶向整合（HITI）和非獨立的同源重組整合（HDRI）開發了由CRISPR/Cas9介導的內源性基因標記系統（EGT），分別通過這2種方式標記了尖孢鐮刀菌FoCHS5、FoSSO1基因的C′端以及FoSSO2的N′端，并利用該標記系統判斷這3類基因在該菌生長發育過程中的表達位置及強弱，以此促進調控因子或毒力因子的研究[38]。

3 存在的問題

3.1 基因編輯效率低是影響CRISPR/Cas9系統進一步推廣的重要原因

隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術在植物病原真菌中應用的進一步探究，其局限性也逐步展現出來。首先便是編輯效率普遍不高，目前主要是利用該方式探索靶標基因的功能，從而挖掘其分子層面的致病機理。效率低下表現為突變個體較少，并且在遺傳至下一代時會出現基因逐漸復原的現象，這使得無法短時間內將有益基因廣泛傳播。雖然可以嘗試改善試驗方案來緩解，但是也產生了未知因素，譬如上述應用于稻瘟菌的共同編輯策略雖然減少了脫靶，卻也導致突變降低[15]。效率低下還表現為易產生意外突變，這使得編輯的不穩定性大大增加，譬如上述應用于膠孢炭疽菌和小球腔菌時多余的序列插入帶來的兩面性[20，28]，額外突變產生的未知影響還有待考證，其次是否也可以利用該影響設計出定向的雙突變還不得知。效率低下還可以表現為脫靶率較高，即sgRNA對目標基因特異識別能力較弱，譬如上述應用于玉米黑粉菌時由于使用混合的破壁酶制備原生質體增加了脫靶[24]。在這些因素有效解決之前很難將該基因編輯方式的應用進一步擴大。

3.2 SgRNA設計工具是影響結果準確性的原因

SgRNA是CRISPR/Cas9系統的核心構件，它設計的質量將直接影響編輯效率和靶向特異性。由表1可以看出，sgRNA設計工具不盡相同，由于不同工具所基于的數據和算法不同，甚至設計的側重點不同，譬如激活、敲除等，這些因素都會影響sgRNA相對質量。當前sgRNA設計工具的權威性也沒有統一標準，較好的諸如GPP Web Portal[39]、CHOPCHOP[19]、E-CRISP[40]等軟件。雖然這些工具都具有相對不錯的反響，但是歸根結底都是計算機模型預測的結果，難免會出現與實際相違背的情況。目前sgRNA設計工具更多的作用是簡化了試驗程序，對結果的影響還需要進一步驗證。

3.3 突變檢驗方式是影響結果準確性的原因

突變檢驗是對編輯結果進行驗證的必要環節，通過表1可以看出，不同病原真菌的檢驗方式不盡相同。宏觀上可利用表型變化、抗性變化等進行篩選，進而將不符合預期表型或抗性的個體作為非突變體剔除。由于基因在被編輯的過程中穩定性無法料知，一方面可能發生sgRNA特異性偏失進而造成非目標位點意外突變或者細胞在生長過程中由于某些因素造成目標突變基因未能正常表達等;另一方面在已確認為正確突變的個體中可能存在由基因漂移導致的突變，即非基因編輯直接導致的變化等，這些因素都會造成宏觀檢驗上對編輯效率認知的偏差。相比之下，分子水平上的檢驗更為嚴謹，即對基因測序驗證其結果。盡管該方式較繁瑣，或許可以利用統計學知識隨機取樣進而估算出效率。

4 展望

4.1 進一步擴大探索CRISPR/Cas9系統應用于植物病原真菌的范圍是未來研究的重點

CRISPR/Cas9系統目前雖然已經取得了很多研究成果，但其在應用中的用途仍處于初期。當前相關報道多數只是為了對目標位點嘗試能否實現單一突變，對病原真菌應用的范圍仍有很大的提升空間，諸如細胞轉錄的激活與抑制、基因組成像等。此外，目前將該系統應用于病原真菌的種類較少，多數相關報道局限于稻瘟病菌、玉米黑粉菌、鐮刀菌等。在十大植物病原真菌中，灰葡萄菌、小麥條形柄銹菌等目前被CRISPR/Cas9系統應用的相關研究報道較少，未來還有很大的發展空間[41-42]。

4.2 進一步提高CRISPR/Cas9系統的編輯效率是未來研究的熱點

基因編輯效率不高一直是相關研究的壁壘。目前主要通過改善試驗細節來解決，譬如上述稻瘟菌的共同編輯策略[15]、炭疽菌的雜交轉化體系[22]、鐮刀菌的體外組裝RNP直接轉化原生質體方式都表現出了相對較優異的抗脫靶性，應用于鐮刀菌的微同源重組編輯方式同時表現出了高效率與抗脫靶性2個優點[29];此外，Matsuura等研究發現，在適當的范圍內，Cas9和sgRNA的濃度與編輯效率成正比[43];也有研究顯示在非靶序列的種子區域最好要安排不低于3個連續錯誤配對組成[44];以sgRNA設計邏輯為核心更改其細節，例如嵌合sgRNA法，可以進一步降低脫靶[45]。盡管這些方案能否廣泛運用還有待驗證，但都為提高CRISPR/Cas9系統的編輯效率奠定了基礎。

4.3 進一步探索適合真菌特性的新型基因編輯技術是未來研究的難點

整體上看，當前主要能夠改善基因編輯的方法集中在sgRNA的特異性、啟動子的合理選擇、Cas9的修飾以及轉化方式的改良等。如何使得該技術能夠順利對目標基因高效修改并盡可能降低不良影響是目前需要完善和突破的地方。隨著對植物病原真菌致病基因探究的進展，更多潛在的編輯方式會被發現與優化，將為植物病原真菌致病功能基因挖掘、定向遺傳育種、RNA的轉錄調控以及對特定基因組實施表觀遺傳學修飾等方面提供重要研究意義。

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