醬香型白酒釀造過程中微生物多樣性及代謝過程研究進展

劉 正，秦培軍，盧延想，吳知非，張長霞，李細芬，梁慧珍*

（1.貴州國臺酒業集團股份有限公司，貴州 仁懷 564501；2.天津科技大學 生物工程學院，天津 300457）

中國白酒源遠流長，醬香型白酒更是享譽世界，深受國內外消費者好評。相較于其他香型白酒，醬香型白酒釀造過程中具有高溫制曲、高溫堆積、高溫發酵、大量用曲和多輪次發酵的特點。生產流程中復雜的微生物變化及相關代謝過程一直是業內研究的重點。

茅臺鎮獨一無二的釀造環境與大量釀酒功能微生物長期選擇性富集直接相關[1]。釀造功能微生物主要有細菌、酵母菌、霉菌和放線菌，細菌主要產蛋白酶與醬味物質；霉菌是糖化動力來源；酵母主要產酒產香；放線菌代謝的次級代謝產物對微生態具有一定生物調控作用[2]。不同釀造工序中微生物組成、豐度各不相同；各種微生物形成復雜的微生態系統，伴隨著大量微生物動態變化、能量傳遞及物質生成。研究醬酒釀造過程中微生物多樣性及代謝過程有利于科學溯源醬香型白酒風味物質，對優化生產工藝，提高產品質量有重要指導意義。

1 醬香型白酒釀造過程中細菌多樣性及代謝過程研究

1.1 醬香型白酒釀造過程中細菌多樣性

所謂“曲是酒之骨”，高溫大曲作為醬香型白酒釀造過程中重要的糖化劑及生香劑，為白酒釀造提供微生物動力，與酒質密切相關。高溫大曲以芽孢桿菌（Bacillus）、乳酸菌（Lactobacillus）和醋酸菌（Acetobacter）為主，伴隨少量霉菌、放線菌及微量酵母菌[3-4]。大曲發酵過程呈高溫高濕狀態，細菌數量整體呈升高趨勢；酵母菌和霉菌數量呈降低趨勢。不同發酵階段大曲中細菌組成變化明顯，各階段優勢細菌如表1所示[5]。

表1 不同發酵階段高溫大曲優勢微生物Table 1 Dominant microorganisms of high temperature Daqu during different fermentation stages

柳習月等[6]指出高溫大曲中優勢細菌主要為克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、芽孢桿菌屬、高溫放線菌屬和糖多孢菌屬（Saccharopolyspora），總相對豐度平均為85.65%。通過線性判別數值分析，分別將芽孢桿菌屬、糖多孢菌屬作為白曲、黃曲的生物標志物。大曲中優勢細菌群落分布具有趨向性：乳酸桿菌在大曲表層所占比例達55.9%～80.9%；芽孢桿菌則集中在大曲曲心，占24.7%～68.6%[7]。

不同釀造原料中的細菌多樣性存在一定規律：窖泥細菌多樣性最為豐富、大曲次之、酒醅及黃水中細菌多樣性最低[8]。同一輪次不同堆積時期的變化趨勢為堆積中期＞堆積后期＞堆積前期[9]，乳酸桿菌屬、埃希氏菌屬（Escherichia-Shigella）和芽孢桿菌屬在堆積發酵過程中占主導地位。窖池發酵前期，糟醅中以酵母菌為主；隨著窖池厭氧發酵，乳酸桿菌持續產酸，糟醅pH降低，霉菌及酵母菌被抑制，芽孢桿菌、乳酸桿菌大量繁殖。至窖池發酵后期，細菌多樣性已從多菌屬共生結構轉變呈乳酸桿菌屬主導的生態結構[10-11]。

近年來，七個輪次釀造環境及糟醅中微生物群落結構相關研究也多有進展。王琳等[12]研究指出，1輪次釀造環境中細菌菌群與其他輪次之間存在顯著差異性，克羅彭斯特菌屬、魏斯氏菌屬、克羅諾桿菌屬（Cronobacter）等16個細菌屬是造成各輪次差異的主要細菌種群。WANG L C等[11]對4、5、6、7輪次出窖糟醅細菌多樣性進行主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），發現4、5、6、7輪次出窖糟醅細菌多樣性趨于一致。4輪次堆積前后糟醅和5輪次堆積前后糟醅的細菌多樣性差異較小，5、6輪次差異較大，6、7輪次差異較小。進一步解釋了4、5輪次酒質相似，6、7輪次酒質相似的原因。

1.2 醬香型白酒釀造過程中細菌代謝過程及代謝產物

細菌代謝過程中涉及到白酒中多種主要香氣成分的生成，如雜醇油、吡嗪類、吡啶類物質等。以乳酸桿菌為代表的細菌主要通過丙酸代謝途徑合成并參與蘇氨酸代謝途徑生成正丙醇[13]。盧建軍等[14]進一步證實面包乳桿菌（Lactobacillus panis）代謝生成正丙醇能力最強，產量為263.7 mg/L。徐巖等[15]篩選出高產乙偶姻及四甲基吡嗪的芽孢桿菌，明確了四甲基吡嗪在細菌中的代謝途徑；張小龍等[2]比較產香細菌代謝產生的四甲基吡嗪、乙偶姻和2,3-丁二醇的含量關系，佐證了這一觀點。WANG P等[16]進一步指出地衣芽孢桿菌與吡嗪含量的相關性。柳習月等[6]通過冗余分析，發現芽孢桿菌、葡萄球菌（Staphylococcus）、糖化酶和四甲基吡嗪之間有很強的相關性。WANG P等[17]認為芽孢桿菌孢子中的2,6-吡啶二甲酸在高溫發酵階段大量積累，并經多輪次發酵轉化為各吡啶類化合物，成為茅臺酒特征香味物質。郭學武等[18]總結了目前報道中釀造功能細菌及其主要謝產物，如圖1所示。

圖1 白酒生產中功能細菌主要代謝產物Fig.1 Main metabolites of functional bacteria in Baijiu production

芽孢桿菌除了代謝產生香氣物質外，還通過激活釀酒微生態中氨基酸的生物合成，促進其他呈香物質產生。如WU Q等[19]向固態發酵培養基中添加地衣芽孢桿菌，激活了半胱氨酸的生物合成，提升了2,3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮、四甲基吡嗪等物質含量。苯丙氨酸代謝可為醬香型白酒提供花果香，產生肉桂酸，對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸等有機酸；苯乙酸、苯乙醇、苯乙醛、香草醛等多種香味物質。高溫大曲中苯丙氨酸代謝代謝具有普遍性，芽孢桿菌、克羅彭斯特菌屬、片球菌屬、糖多孢菌屬均可進行苯丙氨酸代謝[11]。HE G Q等[20]進一步指出，芽孢桿菌與苯乙醇和苯乙酸等芳香化合物有較強的正相關關系。醬香型白酒中多種香氣物質與微生物的關聯性見表2[11]。

表2 醬香型白酒中多種香氣物質與微生物的關聯性Table 2 Correlation between aroma compounds and microorganisms in sauce-flavor Baijiu

續表

2 醬香型白酒釀造過程中酵母菌多樣性及代謝過程研究

2.1 醬香型白酒釀造過程中酵母菌多樣性

酵母菌在高溫環境無法生存，因此在高溫大曲中含量甚微。酵母菌主要分布在糟醅堆積過程及入窖發酵前期。糟醅堆積過程富集了環境中酵母菌及大曲優勢菌，在淘汰了部分雜菌的同時為入窖發酵提供微生物動力和酶動力，對各類風味前體物質的形成奠定基礎[9，21]。涂昌華等[22]研究了茅臺酒廠下沙、糙沙輪次堆積發酵酒醅的微生物多樣性及動態變化規律：糟醅堆積初期，微生物以細菌為主；隨著堆積進行，酵母菌逐漸成為優勢菌株，至入窖前數量可達107～108CFU/g酒醅。

窖池發酵是堆積過程的延續。由于酵母菌對溫度敏感，窖池上層糟醅中酵母菌豐度最高、中層其次、下層最低。崔守瑜等[23]對不同輪次下窖糟醅進行檢測，發現酵母菌是入窖糟醅的優勢菌，數量可達到106～107CFU/g。隨著厭氧發酵進行，窖池溫度升高，溶氧降低，酵母菌和乳酸菌此消彼長，出窖糟醅中酵母數量均＜10 CFU/g酵母。在7個輪次發酵中，酵母菌整體豐度呈波浪式變化。

不同輪次糟醅中的酵母菌種類和數量差異明顯，下沙、糙沙輪次以庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）為絕對優勢酵母菌；隨著輪次遞增，酒醅中優勢酵母菌的種類增多，主要優勢酵母菌有庫德里阿茲威畢赤酵母、滿洲畢赤酵母（Pichia manshurica）、拜爾接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和念珠酵母（Candida apicola）。糟醅中酵母菌多樣性在完整發酵周期內呈現先升高再減低的態勢，以3輪次糟醅中的酵母菌最為豐富[24]。

2.2 醬香型白酒釀造過程中酵母菌代謝過程

酵母菌對產酒率及香味組分形成具有重要作用。盧君等[25]向4輪次糟醅中外源添加耐酸釀酒酵母NJ2和粟酒裂殖酵母LJ3，發現出窖糟醅基酒產量提高了13.47%～25.97%，且其他風味指標沒有明顯差異。王曉丹等[26]將德巴利酵母（Debaryomyces coudertii）FBKL2.0130和FBKL2.0310添加到糙沙輪次堆積糟醅中模擬窖池發酵，出窖糟醅中多元醇含量分別增加1.418 mg/g和1.461 mg/g。周鈺涵等[27]將釀酒酵母與球擬酵母混合發酵，發現后者在保持釀酒酵母產乙醇能力的同時提高其產酯能力。劉建學等[28]研究發現戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）和釀酒酵母共發酵時可以提升菌株產酸和產乙醇能力。田源等[13]認為酵母菌主要在糟醅入窖發酵前7 d產正丙醇，釀酒酵母和庫德里阿茲威畢赤酵母是正丙醇合成優勢菌株，主要通過2-甲基蘋果酸代謝途徑和蘇氨酸代謝途徑合成正丙醇。酵母菌代謝產生正丙醇途徑如下：

3 醬香型白酒釀造過程中霉菌多樣性及代謝過程研究

3.1 醬香型白酒釀造過程中霉菌多樣性

長期的釀造環境選擇性富集了大量功能霉菌，這些霉菌在敞開式制曲、堆積過程中進入釀造體系并發揮作用。因為不同釀造環境霉菌多樣性不同，不同廠區霉菌種類及數目也存在差異[29]。霉菌生長喜濕喜熱，在高溫大曲發酵中前期出現頻率較高，并在培曲中前期達到頂峰[30]。霉菌作為高溫大曲的主要真菌，其豐度低于細菌，高于酵母菌。夏玙等[31]研究發現，根毛霉屬（rhizomucor）、曲霉菌屬（Aspergillus）等霉菌是大曲中的優勢真菌類群。朱治宇等[32]進一步明確了黃曲霉、絲衣霉（Byssochlamys）、紅曲霉（Monascus）等6種霉菌屬是高溫大曲中的優勢霉菌；鏈格孢霉（Alternaria）、黃曲霉、絲衣霉等13種霉菌屬是醬香白酒釀造環境中的優勢霉菌。

堆積過程中霉菌整體呈顯著下降趨勢，優勢菌株有曲霉、絲衣霉、被孢霉（Mortierella）等[33-34]：堆積初期，霉菌數量比酵母菌高1～2個數量級，隨著堆積時間延長，除堆下位置霉菌略有增長外，其余各堆點都呈現下降趨勢，堆心下降尤為明顯。

窖內發酵是堆積發酵的延續，優勢霉菌主要為青霉菌和曲霉菌。窖池內氧氣含量自上到下呈梯度減少，而霉菌又屬于好氧微生物，因此，入窖后霉菌數量也呈現梯度分布：上層＞中層＞下層[23]。張元洪[35]總結了南北方不同品牌醬香型白酒入窖發酵過程中霉菌變化規律，發酵開始后霉菌數量急劇下降，發酵至第7天霉菌數量短暫回升，發酵后期菌體數量再次呈現出減少態勢，直至發酵結束。不同霉菌在窖池發酵過程中消長規律不盡相同：窖內發酵酒醅的優勢霉菌為青霉菌屬和曲霉屬[36]，隨發酵進行數量逐漸減少，發酵中后期又有所回升，直至發酵結束所占比例再下降；紅曲霉則隨著發酵進行數量逐漸增加；枝孢屬霉菌（Cladosporium）則是發酵前期的優勢菌株，隨發酵進行不斷降低，直至無法檢出。

3.2 醬香型白酒釀造過程中霉菌代謝過程

霉菌作為大曲、糟醅發酵的主要糖化動力源，能夠分泌糖化酶、液化酶、纖維素酶、蛋白酶、酯化酶、脂肪酶、果膠酶、漆酶等重要酶類，對原料中淀粉、蛋白質等的降解具有重要催化作用。原料經酶解后生成糖類及氨基酸，供其他微生物生長代謝利用，進而為醬酒風味物質的產生提供基礎[35]。不同種類霉菌產酶種類和酶活差異較大[37]：曲霉主要產糖化酶、蛋白酶、果膠酶等；毛霉主要產糖化酶和蛋白酶；根霉主要產糖化酶；青霉主要產脂肪酶和果膠酶。

常呂珍等[38]選取的黑曲霉F5代謝產生糖化酶，可以將釀酒酵母產乙醇能力提高至32.2%。魯珍等[39]從高溫大曲中篩選出一株高產酶的黑曲霉，固態發酵后可產36.85%的酚類、9.29%的醇類和5.86%的呋喃類物質，其中2-甲氧基苯酚、4-乙烯基愈創木酚含量最高為17.21%、14.88%。王曉丹等[40]從高溫大曲中分離出一株姆斯特丹散囊菌（Eurotium cristatus）。該菌株高產糖化淀粉酶、酸性蛋白酶、果膠酶、脂肪酶與纖維素酶，其固態發酵代謝產物以高級醇、酮和呋喃類為主，有很強的花香和水果香，同時有菜香、草香和木香，對醬香型白酒的風味形成具有貢獻。

4 醬香型白酒釀造過程中放線菌多樣性及代謝過程研究

4.1 醬香型白酒釀造過程中放線菌多樣性

放線菌代謝產物對釀酒功能微生物有代謝調控作用，進而影響香氣物質產生。作為細菌的一個分支，放線菌較難通過傳統純培養方法分離，因此研究相對較少。近年來隨著高通量測序等檢測技術的發展，功能放線菌研究才逐漸深入。從醬香型白酒釀造過程中分離出的放線菌以高溫放線菌科為主，具體科屬如表3[41]所示。

表3 醬香型白酒釀造過程中主要放線菌屬Table 3 Main Actinomycetes during the fermentation of sauce-flavor Baijiu

釀造過程中放線菌主要源于土壤，因此窖泥中放線菌含量最高，大曲中次之，酒醅中含量最低。王曉丹等[42]對高溫大曲進行高通量分析，發現大曲中高溫放線菌屬是優勢菌，含量最高達66.10%；程才瓔等[9]通過聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electro-phoresis，PCR-DGGE）檢測，發現高溫放線菌屬是大曲和堆積酒醅中共有的優勢菌群之一；黃蘊利等[43]對糟醅進行高通量分析，發現堆積酒醅中僅存在1.37%的高溫放線菌屬。

4.2 醬香型白酒釀造過程中放線菌代謝過程

放線菌代謝產物對酒體呈味物質的影響源自兩方面。一方面，放線菌本身代謝產生或降解呈味物質：羅小葉等[44]篩選的3株放線菌代謝產物中酯類物質含量分別占62.80%、59.23%和46.77%，并且可以產生吡嗪類、少量酮類、醛類、酚類等物質；酒體土腥味、土霉味產生的直接原因—土霉素，則是由鏈霉菌代謝產生[45]。羅青春等[46]從窖泥中篩選出一株原玻璃蠅節桿菌（Arthrobacter protophormiae），對正丙醇降解率可達91.2%。

另一方面，放線菌代謝產物對其他產香微生物有促進或抑制作用，進而控制香氣產物的代謝生成。施思等[47]將鏈霉菌代謝產物分別添加至細菌種子液、酵母菌種子液中進行固態發酵。通過代謝通路分析，放線菌對芽孢桿菌的主要調控代謝路徑有丙酮酸代謝、硫代謝、糖酵解途徑；對酵母菌的主要調控代謝路徑有淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝和苯丙氨酸代謝，從而促進苯乙醛還原苯乙醇及苯乙醇酯化生成乙酸苯乙酯。鏈霉菌分泌的七烯大環內酯類抗生素及鹽霉素會對釀造微生物產生拮抗作用：DU H等[48]發現土臭素產生菌—桑普索尼鏈霉菌QC-2會顯著抑制釀酒酵母和霉菌生長，且成熟期菌株對酵母抑制作用最明顯。其通過抑制酵母菌中3-辛醇、3-甲基丁醇、辛酸乙酯和癸酸乙酯的產生，最終導致酵母香氣物質產生量降低；尤小龍等[49]篩選的白色鏈霉菌S5對地衣芽孢桿菌存在顯著抑制；ZHI Y等[50]篩選出的枯草芽孢桿菌2-16和解淀粉芽孢桿菌1-45則可以顯著抑制57.8%和84.3%桑普索尼氏酵母菌的生長。

放線菌除了影響呈味物質外，還通過產酶來調節釀酒微生態。王芙蓉[51]從高溫大曲中分離出一株普通高溫放線菌（Thermoactinomyces vulgaris），淀粉酶活力可達815.54 U/g烘干大曲；分離自高溫大曲的可可鏈霉菌（Streptomyces cacaoi）和沙阿霉素鏈霉菌（Streptomyces zaomyceticus）產果膠酶能力突出，最高可達299.66 U/g[44]；白成松等[52]從酒糟中篩選出一株產色高溫單孢菌（Thermomonospora chromogena），該菌株產淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶能力均較強。

5 展望

從高溫制曲、高溫堆積再到窖池發酵，醬香型白酒釀造過程存在著“多菌共酵”的固態發酵形式。當前釀酒功能微生物相關研究多針對于單一或少數幾種菌株，而對釀造微生物群落動態變化及其代謝過程變化規律有待深入研究。了解釀酒功能微生物作用機理，對解析醬酒香氣組分來源，提升酒質意義重大。隨著分析檢測技術的進步，國內外學者更多從分子生物學、生物信息學、多組學聯用等角度開展釀酒功能微生物演替規律研究，這有利于進一步揭開醬香白酒特征風味物質與微生物動態變化規律及其代謝產物之間關聯的神秘面紗。