紅谷黃酒發酵過程中細菌群落結構分析及其對高級醇的影響

王春艷，鄧 洲，武思雨，陳麗岳，楊炎凱，羅建成

（南陽理工學院 河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室，河南 南陽 473004）

黃酒是世界上最古老的酒類之一，與啤酒和葡萄酒并稱為“世界三大古酒”。2019年4月1日起實施的中華人民共和國國家標準GB/T 13662—2018《黃酒》對黃酒進行了更為準確的定義。黃酒是以稻米、黍米、谷、玉米、小麥、水等為主要原料，經加曲和/或部分酶制劑、酵母等糖化發酵劑釀制而成的發酵酒。黃酒按其產品風格分為傳統型黃酒、清爽型黃酒和特型黃酒。黃酒釀造的原料非常豐富，極大促進了黃酒的多元化發展。目前，市場上有糯米黃酒[1]、玉米黃酒[2]、青稞黃酒[3]、燕麥黃酒[4]、苦蕎黃酒[5]等。紅色釀酒谷子（簡稱紅酒谷或紅谷）是南陽盆地的特產，具有較高的營養價值[6-7]。南陽因紅谷黃酒的發展被評為世界美酒特色產區，但是目前對南陽紅谷黃酒的研究還非常薄弱。

高級醇俗稱“雜醇油”，指含3個以上碳原子醇類的總稱，是黃酒釀造過程中微生物通過氨基酸降解代謝和糖代謝產生的主要風味物質[8-9]，適量的高級醇給人一種醇香宜人的感受，但高級醇過量則容易引起異雜味和致醉性[10-11]。黃酒中的高級醇主要有異丙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇等[12-13]，釀造原料以及工藝的不同都會導致黃酒中高級醇類別和含量的差異。

本研究以南陽紅谷為原料通過蒸米工藝釀造黃酒，采用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法對紅谷黃酒釀造過程中產生的高級醇種類和含量進行鑒定，同時采用高通量測序技術對其細菌群落結構進行解析，最后利用Spearman統計學方法對兩者之間的相關性進行預測，以期更好的了解南陽紅谷黃酒高級醇產生的微生物機制，為更好的品質控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅谷：南陽新野縣；麥曲：山東梁山徐曙生物工程有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；3-辛醇（色譜純）：美國Sigma公司；基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；QIAquick膠回收試劑盒：德國QIAGEN公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DNP-9082電熱恒溫培養箱：上海精宏試驗設備有限公司；LDZX-50FB立氏壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀、HP-INNOWAX色譜柱（60 m×250 μm×0.5 μm）：美國安捷倫科技有限公司；T100TM梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Bio-Rad公司；Miseq高通量測序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 紅谷黃酒的發酵[7]

采用傳統攤飯法釀造紅谷黃酒，取0.25 kg紅谷淘洗干凈，置于潔凈的1 L燒杯內，加自來水浸泡，燒杯口用兩層無菌紗布覆蓋，早晚各換1次水，室溫下浸泡24 h。將瀝干水分的紅谷攤平在托盤中，放入蒸箱中蒸1 h，攤涼冷卻至35 ℃。麥曲接種量為10.0%，釀酒酵母接種量為0.45%，均勻攪拌后，裝入黃酒發酵罐中，依次用封口膜（扎孔）和紗布進行封罐。將黃酒罐放置28 ℃恒溫培養箱發酵24 d，發酵前期對其進行攪拌，使其充分發酵。

1.3.2 紅谷黃酒發酵過程中樣品的選取

分別取發酵第0天（投料當天）、2天、4天、6天、9天、12天、18天、24天的樣品10 g，樣本分別命名為A0、A2、A4、A6、A9、A12、A18、A24，4 000 r/min離心10 min，取上清液用于測定高級醇，剩余樣品轉入無菌離心管中，-20 ℃保存，用于微生物高通量測序分析。

1.3.3 紅谷黃酒高級醇的測定

采用GC-MS法對紅谷黃酒中的高級醇進行檢測[12]。

樣品前處理：取8 mL已離心的紅谷黃酒發酵液加入20 mL頂空瓶中，再加入1.5 g NaCl和25 μL內標物（質量濃度為300 mg/L的3-辛醇）。采用頂空進樣器處理樣品，樣品處理溫度60 ℃，定量環/閥溫度100 ℃，傳輸線溫度110 ℃，樣品處理時間45 min，壓力平衡時間0.25 min，進樣時間1 min。

氣相色譜-質譜條件：進樣口溫度240 ℃；升溫程序為50 ℃保持2 min，以3 ℃/min升溫至80 ℃，再以5 ℃/min升溫至230 ℃，保持10 min；載氣為高純氦氣（He），流速1 mL/min；電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；掃描范圍29～350 u。

定性和半定量：通過美國國家標準與技術研究院（na tional institute of standards and technology，NIST）譜庫對比高級醇物質進行定性，采用內標法進行半定量。

1.3.4 紅谷黃酒細菌群落結構分析

使用基因組DNA提取試劑盒提取紅谷黃酒微生物基因組總DNA，以其為模板，采用引物B341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和B785R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）PCR擴增16S rDNA V3-V4區基因序列。PCR擴增體系：2×Taqmaster Mix 15 μL，DNA模板10 ng，10 μmol/L正反向引物各1 μL，雙蒸水（ddH2O）補充至30 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計25個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物切膠純化后進行精準定量，送杭州開泰生物技術有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

為得到高質量的測序數據，以提高后續生物信息分析準確性，使用Vsearch的fastq_mergepairs命令進行序列拼接，然后使用Cutadapt軟件去除序列中的引物，最后使用Vsearch的fastq_filter命令去除含有N堿基以及堿基長度＜100 bp的低質量序列。97%相似性水平下對非重復序列（不含單序列）進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析，同時采用Denovo模塊去除嵌合體序列。選取OTU代表序列與Silva數據庫進行比對，使用Mothur軟件找出與OTU序列相似度最高且可信度達80%以上的物種信息用于OTU注釋，從而完成不同水平下的每個樣品的群落結構分析。

1.3.5 紅谷黃酒高級醇與細菌群落相關性分析

利用RStudio中的psych軟件包計算高級醇與細菌群落之間的Spearman相關系數R，以R＞0.5且P＜0.05為閾值找出可視化對象，選用Gephi 0.92進行可視化，以表征微生物與高級醇之間的相關性[14]。

2 結果與分析

2.1 紅谷黃酒發酵過程中高級醇的動態變化

紅谷黃酒發酵過程中高級醇種類及含量的變化見表1。

由表1可知，紅谷黃酒整個發酵過程中共檢測到包括異丙醇在內的15種高級醇。投料當天（0 d），檢測出2種高級醇，分別為異丁醇和異戊醇。在整個發酵過程中，穩定存在的高級醇（檢出次數≥4）包括正丙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、β-苯乙醇、異丁醇、異戊醇、叔己醇、2,3-丁二醇和3-甲硫基丙醇，其中正戊醇（4.29～16.24 μg/L）、叔己醇（6.24～16.32 μg/L）和3-甲硫基丙醇（9.96～15.73 μg/L）含量較低；除投料當天（0 d），其余發酵時間（2～24 d）均有檢出的是正丙醇、正丁醇、β-苯乙醇、異丁醇、異戊醇和2,3-丁二醇，其中異戊醇和異丁醇是本次黃酒發酵檢測到的含量最高的兩種高級醇，分別占高級醇總含量的70.88%～74.36%和15.81%～18.76%。檢出次數＜4的高級醇包括七甘醇、1,2-丁二醇、2-乙氧基丙醇、2-乙烯氧基乙醇、2-乙氧基丙醇。發酵后期（9～24 d）高級醇含量顯著增加，發酵至第18天達到最高，為18 843.10 μg/L。

表1 紅谷黃酒發酵過程中高級醇種類及含量的變化Table 1 Changes of kinds and contents of higher alcohols during red millet Huangjiu fermentation process μg/L

已研究的不同類型的黃酒有紹興機械化黃酒[15]、燕麥黃酒[16]、清爽型黃酒[17]、麥曲黃酒[18]，將其發酵過程中的高級醇種類、主要高級醇平均含量（去除投料當天）與紅谷黃酒進行對比分析，結果發現，燕麥黃酒高級醇種類最多（18種），紹興機械化黃酒種類最少（10種），主要高級醇類型均為異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇3種，清爽型黃酒和紹興機械化黃酒主要高級醇的平均含量較高，是其他類型黃酒的1～2個數量級。在上述5種類型的黃酒中，紅谷黃酒的高級醇種類居中，β-苯乙醇含量相對較低，異丁醇、異戊醇的平均含量高于麥曲黃酒和燕麥黃酒。由此可見，不同釀造工藝、不同風味的黃酒高級醇含量差別較大。

2.2 紅谷黃酒細菌群落結構分析

2.2.1 高通量測序結果及Alpha多樣性分析

利用Illumina Miseq測序平臺得到樣品A0、A2、A4、A6、A9、A12、A18、A24的原始測序數據分別為24 252、22 682、29 071、25 530、22 117、24 631、25 188、20 698條，經過質控得到有效數據，并對其Alpha多樣性進行分析，結果見表2。由表2可知，8個樣品的覆蓋率均＞99.5%，表明試驗測序深度合理，測序結果可以反映真實的樣本情況。4個指數中，香農指數越大、辛普森指數越低，說明群落物種的多樣性越高，Chaol指數和ACE指數越大則表明群落物種豐富度越高[19]。樣本A6的香農指數（1.48）最高，辛普森指數（0.39）最低，Chaol指數（119.33）及ACE指數（156.03）均較高，表明紅谷黃酒發酵第6天時細菌群落多樣性達到峰值，隨著發酵的進行，微生物多樣性和豐富度明顯下降。

表2 紅谷黃酒樣品細菌群落Alpha多樣性分析結果Table 2 Alpha diversity analysis results of bacterial community of red millet Huangjiu samples

2.2.2 細菌群落結構分析

根據高通量測序結果所獲取的信息，基于門水平對紅谷黃酒細菌群落結構進行分析，結果見圖1。由圖1可知，紅谷黃酒細菌群落共注釋到4個門，分別是變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），這與多數黃酒釀造微生物的相關研究一致[20-22]。其中，優勢細菌門（平均相對豐度≥1%）為變形菌門和厚壁菌門，發酵前6天，變形菌門的相對豐度為64.95%～94.98%；發酵第9天至結束，厚壁菌門增長迅速，其相對豐度均＞80%。

圖1 基于門水平紅谷黃酒樣品細菌群落結構分析結果Fig.1 Analysis results of bacterial community structure in red millet Huangjiu samples based on phylum level

為進一步了解紅谷黃酒的細菌群落結構組成，基于屬水平對紅谷黃酒細菌群落結構進行分析，結果見圖2。

圖2 基于屬水平紅谷黃酒樣品細菌群落結構分析結果Fig.2 Analysis results of bacterial community structure in red millet Huangjiu samples based on genus level

由圖2可知，紅谷黃酒細菌群落共注釋到66個屬，其中平均相對豐度≥1%的優勢細菌屬共有7個，分別為魏斯氏菌屬（Weissella）、大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、Lentilactobacillus、乳酪桿菌屬（Lacticaseibacillus）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、克魯沃菌屬（Kluyvera）和腸球菌屬（Enterococcus），非優勢菌屬及未分類的OTU歸為其他（others）。由圖2亦可知，紅谷黃酒發酵過程中細菌群落結構變化顯著，發酵前期（2～6 d）細菌菌群結構較為豐富，Weissella、Oceanobacillus、Enterococcus、Kroppenstedtia和Kluyvera的相對豐度最高值均出現在該階段，Lacticaseibacillus的相對豐度持續增加，Lentilactobacillus未檢出。發酵后期（9～24 d）細菌群落結構相對簡單，僅檢出Lacticaseibacillus、Lentilactobacillus和Weissella。Lacticaseibacillus的相對豐度均＞80%，在第18天達到最高值93.65%，Lentilactobacillus有所增長，最終相對豐度為6.14%。本研究中檢測到的Weissella、Lentilactobacillus、Lacticaseibacillus和Enterococcus同樣存在于已報道的其他類型黃酒發酵過程的優勢細菌組成中[23-25]，而Kroppenstedtia和Kluyvera鮮見報道。

2.3 紅谷黃酒優勢細菌與高級醇的相關性

選取紅谷黃酒發酵第2～24天樣本的優勢細菌屬的相對豐度值與對應采樣時間點的高級醇含量進行相關性分析，計算他們之間的Spearman相關系數R，選取R＞0.5且P＜0.05作為有效的網絡連接并繪圖，結果見圖3。

圖3 高級醇與優勢細菌屬的Spearman相關性分析結果Fig.3 Results of Spearman correlation analysis between higher alcohols and dominant bacterial genera

由圖3可知，與優勢細菌屬相關的高級醇主要為異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇和正丙醇，其中異丁醇與Oceanobacillus、Lentilactobacillus、Lacticaseibacillus、Kroppenstedtia、Kluyvera和Enterococcus均具有相關性，異戊醇與β-苯乙醇均與Oceanobacillus和Weissella具有相關性，正丙醇僅與Kluyvera相關。紅谷黃酒發酵過程的優勢細菌屬中Oceanobacillus是連接最大的屬，其次是Kluyvera和Weissella。結果表明，紅谷黃酒發酵過程中，對高級醇產生起到主要貢獻的細菌菌群為Oceanobacillus、Kluyvera和Weissella。孫樂平等[16]采用與本研究類似的方法研究了燕麥黃酒發酵過程中細菌、真菌群落對高級醇的影響，發現異丁醇與片球菌屬（Pediococcus）和變形桿菌屬（Proteus）等7個屬微生物建立關聯；異戊醇與嗜熱真菌屬（Thermomyces）相關；β-苯乙醇與根霉菌屬（Rhizopus）相關。分析造成關聯不一致的原因可能是與黃酒釀造原料、發酵工藝的不同有關。

3 結論

采用氣相色譜-質譜法從南陽特色紅谷黃酒發酵過程中共檢測到15種高級醇，其中異戊醇、異丁醇含量較高，分別占高級醇總含量的70.88%～74.36%和15.81%～18.76%。采用高通量測序技術對紅谷黃酒釀造過程中的細菌群落結構進行研究發現，黃酒發酵至第6天時，細菌群落多樣性達到峰值，隨著發酵的進行，細菌菌群多樣性和豐富度明顯下降。優勢細菌門（平均相對豐度≥1%）為變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），優勢細菌屬（平均相對豐度≥1%）為魏斯氏菌屬（Weissella）、大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、Lentilactobacillus、乳酪桿菌屬（Lacticaseibacillus）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、克魯沃菌屬（Kluyvera）和腸球菌屬（Enterococcus）。采用Spearman統計學方法對兩者之間的相關性進行分析發現，對高級醇產生主要貢獻的細菌群為大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、克魯沃菌屬（Kluyvera）和魏斯氏菌屬（Weissella）。本研究結果為黃酒高級醇含量有效調控奠定理論基礎。