綿柔型白酒對小鼠酒精性肝損傷的影響作用研究

戴 源，陳杉彬，姜 欣，李紅嬌，姚逸萍，張曉蒙，宋 濤，李一澍，趙文梅，王妍凌，王德良

（1.江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇 宿遷 223800；2.中國食品發酵工業研究院有限公司，北京 100015；3.酒類品質與安全國際聯合研究中心，北京 100015）

酒精飲用后直接作用于人體內的肝臟，少部分會通過血液進入腦部，因此在人體內的代謝主要依賴于肝臟[1]。目前普遍認為長期飲酒容易導致肝臟脂肪變性、纖維化乃至肝硬化等酒精性肝損傷病變，引起相關疾病的發生。但短時間內大量飲酒，比經常性大量酒精攝入更為常見[2-4]。目前酒精性肝病患者人數逐年上升，而有研究表明，較多的初期酒精性脂肪肝和酒精性肝硬化患者并沒有酗酒的病史[5]。可見，酒精性肝損傷與是否長期攝入酒精并不是簡單的線性關系，而更應該與飲用方式、飲用對象、飲用個體等進行相關的綜合考量。目前普遍認為攝入酒精不僅會對肝臟造成損傷，而且會對大腦認知功能產生一定的影響[6]。急性過量的酒精攝入易引起酒精中毒，引起胃出血，誘發心腦血管等疾病。但是目前研究表明，急性酒精攝入對青年人的記憶功能相關腦區與未飲酒人群相比并沒有較大的影響[7-8]。同時通過急性酒精攝入早期腦部灌注改變的動脈自旋標記進行相關分析，也未發現顯著性差異[9]。表明短期攝入酒精并不會對腦部造成損傷。但是急性過量攝入酒精可能會對肝腎等組織造成損害。

過量酒精攝入導致的疾病損傷發生機制較為復雜，致病機理及原因不是十分清晰，可能受到多方面的影響。氧化應激可能是其中較為重要的影響因素，當體內抗氧化機制無法應對產生的大量自由基時，無法維持相應的平衡，過度氧化應激就會破壞細胞的完整性，對細胞造成氧化損傷。酒精會誘導氧化應激和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產生，在增加氧化應激產物的同時減少機體內產生的抗氧化因子，同時釋放相應的細胞因子，導致線粒體功能障礙，引發內質網應激和其他損傷。Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白（Kelch like epichlorohydrin associated protein，Keap1）-核因子E2相關因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）復合物是細胞抗氧化信號調控通路的關鍵因子，細胞氧化的防御機制主要是激活Nrf2抗氧化反應元件信號通路，來達到增強細胞抗氧化能力，控制其蛋白質產物參與解毒和消除反應性氧化劑和親電劑的基因表達[10-12]。Nrf2活性部分由胞漿蛋白Keap1控制，在正常生理條件下，Nrf2蛋白與Keap1同源二聚體在細胞質內形成復合物，然后招募E3泛素連接酶，后者介導Nrf2蛋白的泛素化降解，不促進下游抗氧化相關基因的表達，當受到外源氧化刺激后，會導致Nrf2和Keap1解偶聯，Nrf2蛋白從Keap1二聚體上分離，泛素化降解減少，細胞質內富集的Nrf2蛋白進而轉入細胞核內，激活下游靶基因的表達并發揮抗氧化應激的作用[13-17]。目前通發現較多能夠通過改善抗氧化通路的相關物質均是通過作用于Keap1-Nrf2相關通路發揮作用。

過量的ROS存在于細胞內，能夠誘發氧化應激，導致氧化損傷，進而產生更多損傷[18]。氧化應激和炎癥反應是緊密結合，密切相關的。炎癥是一個復雜的生物學過程，在各種因素的刺激下，多種轉錄因子被激活，這些轉錄因子的激活促進促炎蛋白基因的表達，產生多種促炎介質或細胞因子，影響多種通路相關蛋白的表達，包括誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，INOS）、環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等，引發一系列的炎癥反應，造成細胞及組織的損傷[19-22]。

已有研究表明中國白酒與食用酒精有本質的區別，微量酒體成分的存在豐富了白酒的風味，改善了飲用感受[23-26]。研究證實，部分微量酒體成分或具有減少因過量酒精攝入對機體產生的損傷的作用[27]，即微量酒體成分在其有效濃度范圍內能夠減少酒精性疾病的發生。研究表明，綿柔型白酒中含有核苷類似物等多種活性成分[28]。基于此，本研究通過灌胃食用酒精構建急性肝損傷動物模型，研究綿柔型酒樣中微量酒體成分在肝損傷動物模型中的作用，為白酒不等于食用酒精提供實驗論據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

49～56日齡雄性C57BL/6J小鼠（體質量18～22 g）：由斯貝福生物技術有限公司提供；飼養溫度為（23±2）℃，相對濕度為（50±5）%，光照時間12 h/d，自由飲食，5只/籠，合籠飼養，實驗動物的相關處理均嚴格遵守實驗動物福利倫理與保護相關規定，并隨時接受實驗動物倫理委員會的監督與檢查。

52%vol綿柔型酒樣1#、52%vol綿柔型酒樣2#（非市售，通過氣質聯用等檢測其黃酮類、核苷類、愈創木酚類、吡嗪類等生物活性成分含量不同）：由江蘇洋河酒廠股份有限公司提供；一抗（Nrf2、keap1、COX-2、iNOS與NF-κB）：英國Proteintech公司；二抗（Anti-rabbit）：美國CST公司；谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C），高密度脂蛋白膽固醇（high density liptein cholesterol，HDL-C）試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

EclipseCi-L光學顯微鏡：日本Nikon公司；Mini-PROTEAN Tetra電泳槽：美國Bio-Rad公司；ChemiScope 6000 Exp化學發光成像系統：中國勤翔公司；7500 Fast/7500實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-fqPCR）系統：美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組與造模

實驗小鼠適應性喂養7 d后，將30只小鼠隨機分成3組（包括食用酒精組、綿柔型酒樣1#處理組、綿柔型酒樣2#處理組）。其中食用酒精組灌胃52%vol食用酒精，綿柔型酒樣1#處理組和綿柔型酒樣2#處理組分別灌胃等劑量的52%vol綿柔型白酒1#和52%vol綿柔型白酒2#，灌胃量為12.5mL/kg體質量，灌胃結束后，禁食不禁水，8 h后，眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟組織和血液進行后續實驗，其中將右半部肝臟組織通過10%中性多聚甲醛固定制備石蠟切片，肝臟組織病理學變化采用蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin，HE）染色后觀察；其余肝臟于-80 ℃低溫冰箱保存備用[29]。

1.3.2 小鼠肝臟組織病理學檢查

肝臟組織用10%中性多聚甲醛固定24 h后轉入體積分數70%的酒精溶液中脫水處理24 h，常規石蠟包埋后制作厚度約4 μm的切片，使用C8H10進行脫蠟處理，不同體積分數酒精梯度（95%、90%、80%、75%）脫水，蘇木精染色，鹽酸醇分化；0.5%伊紅染色后常規梯度不同體積分數酒精（75%、80%、90%、95%），體積分數100%酒精I（10 min），體積分數100%酒精II（10 min）再次脫水；最后經二甲苯透明后中性樹膠封片，在Nikon光學顯微鏡Eclipse Ci-L下選取不同的視野拍照并分析肝臟組織病理學變化。

1.3.3 小鼠肝功能的檢測

灌胃8 h后，小鼠眼球取血，靜置30 min，3 000 r/min離心10 min得到血清，并將其轉移至-80 ℃低溫冰箱進行低溫保存。通過賴氏法檢測血清轉氨酶谷草轉氨酶（AST）和谷丙轉氨酶（ALT）水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒使用說明書進行。

1.3.4 小鼠血脂水平的檢測

小鼠體內血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的水平均通過相應試劑盒進行測定。

1.3.5 RT-fqPCR擴增

按Invitrogen試劑盒提取肝組織總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），并根據過氧化氫酶（fungal catalase，CAT）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、微管相關蛋白1A/1B-輕鏈3（microtubule-associated protein 1a/1b-light chain 3，LC3）、P62、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因信使核糖核酸（messenger ri bonucleic acid，mRNA）序列設計PCR引物，CAT引物：上游5'-GGAGGCGGGAACCCAATAG-3'、下游5'-GTGTGCCATCTCGTCAGTGAA-3'；GSH引物：上游5'-GGTTCGAGCCCAATTTTACA-3'、下游5'-GGTTCGAGCCCAATTTTACA-3'；SOD引物：上游5'-CGGTGAACCAGTTGTGTTGT-3'、下游5'-AGTCACATTGCCCAGGTCTC-3'；陽性內參采用GAPDH，引物為：上游5'-CTCAACTACATGGTCTACATGTTCCA-3'、下游5'-TCACACACCAGCAGGTTATCATC-3'。引物合成由上海生工生物技術公司完成。RTfqPCR體系嚴格按照Vazyme試劑盒說明書進行。

1.3.6 數據分析

用SPSS 23.0軟件對數據進行多組間方差分析和T檢驗，所有實驗數據均為3個平行試驗的平均值，結果采用“平均值±標準差”表示；圖表由Origin 2018繪制。

2 結果與分析

2.1 綿柔型白酒對小鼠肝組織病理形態學的影響

由圖1（A）可知，食用酒精組小鼠的肝組織結構、肝細胞排列未見明顯紊亂，主要觀察到中央靜脈、匯管區周圍及肝實質內均可見多量的肝細胞輕度變性，胞質疏松淡染，未發生明顯的炎性改變。由圖1（B）可知，綿柔型酒樣1#處理組小鼠的中央靜脈、匯管區周圍及肝實質內均可見中等量的肝細胞輕度變性，胞質疏松淡染，未見明顯的炎性改變。由圖1（C）可知，肝臟組織被膜由厚薄均勻的富含彈性纖維致密結締組織構成，肝小葉分界明顯，排列規則，肝小葉中央為中央靜脈，周圍是大致呈放射狀排列的肝細胞和肝血竇，肝細胞圓潤、飽滿；肝板排列規則、整齊，肝竇無明顯擴張或擠壓；相鄰肝小葉之間的門管區無明顯異常；未見明顯的炎性改變。本實驗中食用酒精組小鼠的肝組織發現存在較多肝細胞輕度變性情況，而無明顯的炎癥改變，而在綿柔型酒樣1#處理組和綿柔型酒樣2#處理組小鼠的肝細胞輕度變性情況基本一致，但數量更趨向于減少，比實驗預期結果更為明顯。表明在急性飲酒情況下，酒樣中的乙醇已經開始對肝細胞造成損傷，但不會對肝組織形態學造成明顯改變，與其他長期飲酒實驗對肝組織形態學造成影響的結果有一定差異，且綿柔型酒樣1#和2#情況均優于食用酒精組，可能是其中的活性物質對食用酒精造成的肝損傷起到了一定的保護作用，能夠減少酒精帶來的肝損傷危害。

圖1 食用酒精及綿柔型酒樣對小鼠肝組織病理形態學的影響Fig.1 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on the pathological morphology of liver tissue in mice

2.2 綿柔型白酒對小鼠肝臟功能的影響

由圖2可知，與食用酒精組相比較，綿柔型酒樣1#處理組和綿柔型酒樣2#處理組小鼠血清中的AST、ALT水平均有一定程度降低。在AST水平上，綿柔型酒樣1#和綿柔型酒樣2#分別是食用酒精組的81.9%、84.4%，但三者之間均無顯著性差異（P＞0.05）。而在ALT水平上，綿柔型酒樣1#和綿柔型酒樣2#分別是食用酒精組的78%和80%，差異顯著（P＜0.05）。且綿柔型酒樣1#組在AST和ALT水平上均不同程度低于綿柔型酒樣2#組，但兩者之間無顯著性差異（P＞0.05）。表明綿柔型酒樣在一定程度上確實能夠緩解食用酒精造成的肝損傷。

圖2 食用酒精及綿柔型酒樣對小鼠血清中谷草轉氨酶（A）及谷丙轉氨酶（B）活性的影響Fig.2 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on the activities of aspartate aminotransferase (A) and alanine aminotransferase (B) in serum of mice

2.3 綿柔型白酒對小鼠血脂水平的影響

由圖3可知，與食用酒精組相比較，綿柔型酒樣1#組和綿柔型酒樣2#組小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平相較食用酒精組出現下降，而HDL-C水平上升；與食用酒精組相比較，綿柔型酒樣1#組和綿柔型酒樣2#組血清中TC水平分別降低了17%和13%；TG水平分別降低了10.4%和6.5%；LDL-C水平分別降低了7.3%和5.9%；HDL-C水平分別升高了4%和3%。除在TC水平外，其他肝臟相關指標表明，綿柔型酒樣1#對肝損傷嚴重程度要輕于綿柔型酒樣2#，食用酒精造成的肝損傷情況最為嚴重。

圖3 食用酒精及綿柔型酒樣對小鼠血清中總膽固醇（A）、甘油三酯（B）、低密度脂蛋白膽固醇（C）及高密度脂蛋白膽固醇（D）的影響Fig.3 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on total cholesterol (A),triglyceride (B),low density lipoprotein cholesterol (C)and high density lipoprotein cholesterol (D) in serum of mice

2.4 綿柔型白酒對小鼠氧化通路相關分子蛋白表達水平及抗氧化相關指標的影響

Nrf2是CNC轉錄因子家族成員中活力最強的轉錄調節因子，活性主要受到Keap1負性調節，在正常情況下，與Keap1相偶聯，被錨定在胞漿中；當受到外界氧化刺激時，導致Nrf2發生磷酸化，與Keap1解偶聯，轉移入核，和其專性伴侶結合成異二聚體，識別并結合抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）產生功能，Nrf2蛋白為細胞質胞漿蛋白。由圖4及圖5可知，綿柔型酒樣1#組小鼠肝臟中細胞Nrf2細胞質胞漿蛋白表達量最低，綿柔型酒樣2#組次之，食用酒精中最高；細胞質胞漿Nrf2蛋白明顯和Keap1解偶聯進入細胞核中進行相關表達發揮功能。同時Keap1基本不變，在綿柔型酒樣1#和綿柔型酒樣2#中均持平于在食用酒精組中的Keap1蛋白表達量。其對相關蛋白灰度值進行半定量分析，其結果一致。

圖4 食用酒精及綿柔型酒樣處理對小鼠肝組織氧化通路的影響Fig.4 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on oxidative pathway of liver tissue in mice

圖5 細胞質胞漿Nrf2、Keap1免疫印跡結果半定量分析Fig.5 Semi-quantitative analysis of immunoblotting results of cytoplasmic Nrf2 and Keap1

由圖6及圖7可知，與食用酒精組相比較，綿柔型酒樣1#組和綿柔型酒樣2#組在氧化相關指標CAT、GSH、SOD水平相較食用酒精組出現不同程度的升高，其中在CAT和GSH水平升高差異顯著（P＜0.05），而在SOD水平升高差異不顯著（P＞0.05）；綿柔型酒樣1#和綿柔型酒樣2#的CAT、GSH和SOD含量無明顯差異（P＞0.05）。綿柔型酒樣1#和綿柔型酒樣2#均在MDA水平上低于食用酒精組，同時綿柔型酒樣1#略低于綿柔型酒樣2#，且均無顯著性差異（P＞0.05）。在氧化相關通路CAT、GSH、SOD的mRNA表達水平上，綿柔型酒樣1#和綿柔型酒樣2#不同程度的高于食用酒精組，均出現顯著性差異（P＜0.05）；同時綿柔型酒樣1#和綿柔型酒樣2#兩組間無顯著性差異（P＞0.05），在SOD的mRNA水平上，綿柔型酒樣1#組要略高于綿柔型酒樣2#；綜合來看，酒精能夠造成肝損傷的部分原因可能是通過影響氧化應激信號通路的響應機制，使肝細胞內氧化應激調控失衡，造成損傷的結果。

圖6 食用酒精及綿柔型酒樣對小鼠過氧化氫酶（A）、超氧化物歧化酶（B）及還原型谷胱甘肽（C）和丙二醛（D）含量的影響Fig.6 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on contents of catalase (A),superoxide dismutase (B),reduced glutathione (C)and malondialdehyde (D) in mice

圖7 食用酒精及綿柔型酒樣處理組小鼠過氧化氫酶mRNA（A）、還原型谷胱甘肽mRNA（B）及超氧化物歧化酶mRNA（C）相對表達量Fig.7 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on relative expression of catalase mRNA (A),reduced glutathione mRNA (B)and superoxide dismutase mRNA (C) in mice

其中Keap1-Nrf2是一條重要的氧化通路，能夠控制下游相關抗氧化元件、蛋白和相關酶活力來維持氧化平衡，進而應對氧化應激，提高抗氧化能力。在正常條件下，Nrf2與Keap1相偶連形成復合物，被錨定在細胞質胞漿中，不發揮相關的功能；當受到外界氧化刺激時，Nrf2減少了泛素化降解，更多的被磷酸化修飾，與Keap1解偶連，轉移入核，發生相關作用，促進下游相關抗氧化物質的產生[30-31]。在食用酒精組中，明顯可以觀察到有較多的Nrf2進行相關的表達，而在綿柔型酒樣1#組小鼠肝臟中細胞Nrf2胞漿蛋白表達量最低，綿柔型酒樣2#組次之；同時在食用酒精組中，Keap1含量也略低于綿柔型酒樣組中。表明細胞胞漿中Nrf2蛋白更多的參與磷酸化修飾，與Keap1解偶聯，進入細胞核發揮功能。食用酒精組中的氧化相關指標CAT、GSH、SOD水平均比綿柔型酒樣中不同程度的降低，MDA水平升高。同時食用酒精組在氧化相關通路CAT、GSH、SOD的mRNA表達水平上也相應的低于綿柔型酒樣組。綜合來看，酒精能夠通過調控Nrf2是否磷酸化和Keap1相解離進而入核發揮功能，提高相應的抗氧化相關指標的含量及活力，來達到提高抗氧化的目的，緩解酒精造成的氧化應激的壓力。同時，綿柔型酒樣相較于食用酒精來說，更能夠刺激Nrf2蛋白進入細胞核進行相關表達。

2.5 不同酒樣對小鼠肝損傷炎癥通路相關分子蛋白表達水平的影響

除了因為氧化應激對肝臟造成損傷，炎癥也是危害之一。誘導型一氧化氮合酶（INOS）在炎癥誘導下生成NO，是體內重要的生物活性分子和信號分子[32]；環氧化酶-2（COX-2）是一種在正常組織中較少表達的誘導酶，可以快速應答一系列促炎介質和細胞因子[33-35]。由圖8及圖9可知，與食用酒精組相比，綿柔型酒樣1#處理組和綿柔型酒樣2#處理組的炎癥通路相關蛋白INOS、COX-2、NF-κB的蛋白表達量均不同程度的降低，其中INOS下降趨勢更為明顯，而COX-2和NF-κB的蛋白表達無顯著變化；通過對相關蛋白印跡進行半定量發現，綿柔型酒樣1#處理組和綿柔型酒樣2#處理組炎癥相關蛋白均不同程度降低，均在食用酒精組中表達最高。相對于食用酒精組，在INOS蛋白表達方面，綿柔型酒樣1#和綿柔型酒樣2#分別下降了13%和7%；在COX-2和NF-κB蛋白表達方面，分別降低了3.6%、3.7%，3%、4%，但均無顯著性差異（P＞0.05）。表明通過急性飲酒后，對于體內炎癥相關通路而言，食用酒精、綿柔型酒樣1#和綿柔型酒樣2#均能造成負面影響，但造成的程度不同，其中食用酒精程度較高、綿柔型酒樣2#次之。

圖8 食用酒精及綿柔型酒樣處理對小鼠肝組織炎癥通路的影響Fig.8 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on inflammatory pathway of liver tissue in mice

圖9 炎癥相關通路INOS、COX-2和NF-κB免疫印跡結果半定量分析Fig.9 Semi-quantitative analysis of western blot results of inflammation related pathways INOS,COX-2 and NF-κB

3 結論

為評價急性期內綿柔型酒中微量酒體成分的存在是否與食用酒精存在異同及相關微量成分的生理作用，采用兩種綿柔型白酒和食用酒精灌胃小鼠，觀察對小鼠急性酒精性肝損傷的影響作用。食用酒精組小鼠與綿柔型酒樣1#組和綿柔型酒樣2#小鼠相比較，健康程度及存活率基本無變化，通過病理切片顯示，不論是食用酒精組小鼠還是綿柔型酒樣組小鼠，均未對肝組織造成明顯損害影響，均未發生炎性改變；但綿柔型酒樣小鼠肝細胞輕度變性數量及情況均要優于食用酒精組小鼠。同時對不同組小鼠肝臟健康相關指標進行比較，結果表明，在食用酒精組中，血清AST、ALT、TC、TG、LDL-C水平均要高于綿柔型酒樣組，同時HDL-C水平明顯低于綿柔型酒樣組。所有肝臟相關指標均能夠表明，綿柔型酒樣1#對肝損傷嚴重程度要輕于綿柔型酒樣2#，食用酒精造成的肝損傷情況最為嚴重。同時綿柔型酒樣相較于食用酒精確實能夠在一定程度上減少酒精性肝損傷的產生。

目前研究結果表明，綿柔型酒樣相較于食用酒精，雖然急性酒精攝入后時間較短，但仍能初步通過影響氧化通路的相關分子表達和炎癥通路相關蛋白的表達，減緩酒精帶來的損害，達到減少氧化應激對肝臟造成損害的目的。表明在有效濃度范圍內，酒體中天然存在的微量功能成分具有減少酒精性損傷的作用。該結果提示在飲料酒生產過程中，通過調控微生態、改進生產工藝等途徑，不斷提高酒體中微量成分的含量，或是開發健康飲料酒的有效策略。