碘化N-正丁基氟哌啶醇通過調控FoxO1減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷

龐海燕，陸兵兒，石剛剛

（汕頭大學醫學院藥理學教研室，廣東 汕頭 515041）

隨著人口老齡化的不斷加劇，心血管疾病的發病率和病死率呈現出逐年增高的趨勢，成為威脅人類健康的一大類公共衛生疾病。而在心血管疾病的治療過程中，心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）損傷已經成為不可忽略的問題。心肌I/R損傷是心肌組織在缺血一段時間后恢復血供，非但沒有使結構和功能得到完全恢復或明顯改善，反而出現比再灌注前更明顯、更嚴重的損傷和功能障礙的現象。臨床上表現為嚴重的和持續性的胸骨后疼痛，伴有血清心肌酶活性升高和進行性心電圖改變，可能伴有心律失常、心臟破裂、休克或心力衰竭[1]。許多觀點認為I/R損傷與氧自由基爆發、線粒體功能障礙、Ca2+超載、炎癥反應以及能量代謝障礙等機制相互關聯、協同作用[2]，這些病理生理變化的分子機制成為了動物實驗和臨床研究的熱點。

碘化N-正丁基氟哌啶醇（F2）是由我們實驗室在氟哌啶醇的基礎上進行哌啶基團的修飾，篩選出的一種新型化合物。F2避免了氟哌啶醇的錐體外系不良反應，保留了擴張冠狀動脈的作用，具有很好的應用前景[3]。以往的研究顯示，F2對心肌細胞和心臟微血管內皮細胞缺氧復氧損傷具有良好的保護作用，其保護機制可能與拮抗鈣超載[4]和減輕氧化應激[5]有關。相關研究表明，F2可增加超氧化物歧化酶活力，降低丙二醛濃度[6]。然而，F2通過何種機制減輕I/R過程中的氧化應激仍不清楚。叉頭框蛋白O1（forkhead box protein O1，FoxO1）可通過上調超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等抗氧化基因的表達，減輕氧化應激[7]。基于F2對缺氧復氧誘導的氧化應激損傷的保護作用以及FoxO1的抗氧化應激作用，本研究在整體I/R模型上探討F2是否通過調控FoxO1來減輕I/R損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物C57BL/6J小鼠，8～12周齡，雄性，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于汕頭大學醫學院實驗動物中心。本研究經汕頭大學醫學院實驗動物倫理委員會審查批準。

1.1.2 主要試劑和儀器戊巴比妥鈉購自德國Merck公司；FoxO1兔多克隆抗體購自美國CST公司；GAPDH鼠多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG、二氫乙錠熒光探針購自上海碧云天生物技術有限公司。小動物呼吸機（上海奧爾科特生物科技有限公司）；Vevo LAZR小動物多模成像系統（加拿大Fujifilm Visual Sonics公司）；TBA-40FR全自動生化分析儀（日本Toshiba公司）；CM1850冰凍切片機（德國Leica公司）；Olympus BX53正置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心肌I/R模型的建立及給藥8～12周齡的小鼠通過腹腔注射1%的戊巴比妥鈉（75 mg/kg）進行麻醉，經氣管插管連接呼吸機（呼吸頻率115，呼吸比1.3∶1，潮氣量2.0）。于小鼠第3和第4肋骨間開胸暴露心臟，撕開心包膜，用8-0的帶針縫線結扎左前降支，通過心電圖出現ST段抬高證實為缺血。小鼠缺血45 min后去除結扎，關閉肋骨間隙并縫合肌肉和皮膚，進行24 h再灌注。給藥：F2于I/R手術前24 h以10 mg/kg的劑量腹腔注射給藥；FoxO1的抑制劑AS1842586（AS）于I/R手術前48 h、24 h、30 min分3次以10 mg/kg的劑量腹腔注射給藥。

1.2.2 小動物多模成像系統檢測心功能小鼠按隨機數字表法分為假手術組（sham組）、模型組（I/R組）、I/R+F2組，每組6只。采用3.0%（體積分數）異氟烷氣體誘導麻醉小鼠，1.0%（體積分數）異氟烷氣體維持麻醉。將小鼠固定在小動物多模成像恒溫操作臺上，使用脫毛膏將小鼠胸部毛發脫除干凈，用MS-400超聲探頭在胸骨旁短軸切面分別采集M-Mode和B-Mode圖像。由圖像數據分析可得左心室射血分數和短軸縮短率。

1.2.3 全自動生化分析儀檢測血清乳酸脫氫酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶的活性小鼠按隨機數字表法分為假手術組（sham組）、模型組（I/R組）、I/R+F2組，每組6只。將小鼠血清用生理鹽水分別稀釋64倍和16倍，吸取稀釋后的樣本100 μL于檢測管，用全自動生化分析儀測定乳酸脫氫酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶活性。

1.2.4 蛋白質印跡法檢測心肌組織中FoxO1蛋白的表達水平小鼠按隨機數字表法分為假手術組（sham組）、模型組（I/R組）、I/R+F2組，每組6只。提取小鼠心肌組織蛋白：按100 mg心肌組織加1 mL蛋白裂解液的比例加入預冷的蛋白裂解液，用乳化分散儀進行組織勻漿，冰上靜置30 min，4℃13 000 r/min離心15 min，收集上清液以相同條件再次離心后收集上清液。BCA法進行蛋白定量后按4∶1的比例加入5倍上樣緩沖液，煮沸5 min變性，冷卻后使用細胞超聲破碎儀在冰上超聲（工作時間3 s，間隔時間5 s，工作次數3次）；SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓50 V）至分離膠后，更換100 V電壓繼續電泳1 h；電轉膜法將蛋白轉移到硝酸纖維素膜；5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h；使用Bio-Rad化學發光儀曝光；使用Image Lab分析軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.2.5 二氫乙錠熒光探針法檢測心肌組織中活性氧的表達小鼠按隨機數字表法分為I/R組、I/R+F2組、I/R+AS組、I/R+AS+F2組，每組6只。取下小鼠心臟制備厚度為8 μm的冰凍切片，將二氫乙錠原液用磷酸鹽緩沖液稀釋3 000倍，每個切片滴加50 μL稀釋后的二氫乙錠，37℃避光孵育30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色5 min，磷酸鹽緩沖液沖洗5 min，滴加抗熒光淬滅封片液，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察染色結果。通過分析熒光強度反映活性氧的表達水平。

1.3 統計學分析

應用SPSS 19.0統計軟件進行分析。計量資料經K-S正態性檢驗符合正態分布，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 F2可改善小鼠心肌I/R后的心功能障礙

與sham組相比，小鼠心肌缺血45 min再灌注24 h后，射血分數和短軸縮短率均降低，差異具有統計學意義（P值均＜0.01）；小鼠I/R手術前給予F2預適應后，射血分數和短軸縮短率均升高（P值均＜0.01），表明I/R導致的心功能障礙得到明顯改善，如圖1所示。

圖1 F2對I/R小鼠心功能障礙的保護作用

2.2 F2可減少小鼠心肌I/R后血清酶的漏出

與sham組相比，小鼠心肌缺血45 min再灌注24 h后，肌酸激酶、肌酸激酶同工酶和乳酸脫氫酶的漏出增多（P值均＜0.01）；I/R手術前給予F2預適應的小鼠肌酸激酶、肌酸激酶同工酶和乳酸脫氫酶的漏出減少（P值均＜0.01），如圖2所示。

圖2 F2對I/R小鼠血清酶漏出的影響

2.3 F2可提高小鼠心肌組織中FoxO1蛋白的表達

與sham組相比，小鼠心肌缺血45 min再灌注24 h后，心肌組織中FoxO1蛋白水平下降，差異具有統計學意義（P＜0.01）；給予F2預適應的小鼠心肌組織中FoxO1的表達明顯提高（P＜0.01），如圖3所示。

圖3 F2對小鼠I/R心肌組織中FoxO1蛋白表達的影響

2.4 FoxO1抑制劑拮抗F2對I/R小鼠心肌組織中活性氧的抑制作用

如圖4所示，紅色熒光強度越強，說明組織中活性氧的含量越高。與模型組（I/R組）相比，F2預處理的I/R小鼠心肌組織中的活性氧含量降低（P＜0.01）；而給予FoxO1的抑制劑AS后，F2對活性氧的抑制作用被拮抗（P＜0.01）。

圖4 F2及FoxO1抑制劑對小鼠心肌組織中的活性氧含量的影響

3 討論

本研究利用整體I/R模型，采用小動物活體多模成像系統檢測小鼠心功能，全自動生化分析儀檢測小鼠血清乳酸脫氫酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶的活性，通過射血分數和短軸縮短率以及血清酶漏出評價I/R損傷程度。研究結果表明，小鼠I/R手術前給予F2預適應可以減輕I/R損傷。這與Lu等[8]的研究中，F2對心肌細胞和心臟微血管內皮細胞缺氧復氧損傷發揮保護作用是一致的。

心肌I/R損傷的發生機制很復雜，氧化應激是導致心肌I/R損傷的主要因素之一。氧化應激是活性氧的產生和抗氧化防御系統之間失衡的結果。研究表明，氧化應激的進一步發展可導致心肌重構[9]。減少氧化應激的發生可以減輕I/R誘導的心肌損傷。我們以往的研究發現F2可以減輕缺氧復氧引起的心臟微血管內皮細胞的氧化應激[5]，但F2減輕氧化應激的保護機制尚不清楚。本研究蛋白免疫印跡結果顯示，F2可以有效提高心肌I/R過程中FoxO1的表達。Mohseni等[7]研究表明，FoxO1可通過轉錄激活超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等抗氧化基因的表達，減輕氧化應激。接著對機制的進一步探索，根據不同處理組中的活性氧含量結果分析，我們發現使用FoxO1的抑制劑AS1842586后，F2減輕氧化應激的保護作用被抑制。這表明F2可以通過對FoxO1的調控減輕氧化應激，從而保護心肌I/R損傷。

綜上所述，本研究在整體水平上證實了F2對心肌I/R損傷的保護作用，并初步證實F2可以通過調控FoxO1的表達，減輕氧化應激，進而減輕心肌I/R損傷。但關于F2具體通過何種途徑調控FoxO1，仍有待研究。在心肌I/R損傷的發病機制和治療的研究進程中，雖然各種抗氧化治療已成功應用于臨床前研究，但事實上將這種抗氧化治療融入臨床實踐還是十分具有挑戰性的，其中一個挑戰就是動物模型與人類狀況的可比性。而面對種種挑戰與困難，仍需要學者們付出大量的時間與努力進行研究克服，盡早攻克這威脅人類健康的一大類疾病。