1型糖尿病患者外周血環狀RNA差異表達分析

林 錕，吳逸希，曾 瓊

（1．汕頭大學醫學院第一附屬醫院內分泌代謝科，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學醫學院第一附屬醫院神經內科，廣東 汕頭 515041）

1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是對兒童青少年危害重大的自身免疫性疾病，其發病機制尚未十分清楚，亦缺乏早期血清學標志物[1]。環狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類特殊非編碼RNA分子，其分子屬封閉環狀結構，表達穩定，不易降解[2]。這使得circRNA在作為新型臨床診斷標記物的開發上具有明顯優勢。這是一種新的、高度敏感的生物標記物，具有很高的價值。研究發現circRNA參與了疾病的發生發展，包括自身免疫性疾病[3]。目前關于T1DM與circRNA的相關性研究較少。本研究假設circRNA通過多種基因表達調控機制影響T1DM的發生發展，在胰島細胞損傷早期circRNA即出現差異表達，由于circRNA的高度穩定性，異常表達的circRNA可在血液中被檢測出并作為未來T1DM一種新的、高度敏感的生物標記物。本研究通過采用circRNA芯片檢測T1DM患者和正常人群外周血circRNA表達譜，采用生物信息學方法預測靶微RNA（micro RNA，miRNA），探討circRNA可能參與的T1DM分子機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2021年7—12月于汕頭大學醫學院第一附屬醫院內分泌科住院治療的T1DM患者3例，均符合T1DM診斷標準。排除標準包括其他類型糖尿病、肝腎功能障礙、急性應激狀態、惡性腫瘤、心腦血管疾患和妊娠患者。同時納入性別、年齡與T1DM患者匹配的健康對照者3名。本研究經汕頭大學醫學院第一附屬醫院倫理委員會審核批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集臨床資料、體格檢查并常規進行血脂、空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血紅蛋白、血脂和肝腎功能檢測。

1.2.2 基因芯片檢測 空腹抽取靜脈血5 mL，放入乙二胺四乙酸，抗凝管顛倒混勻后，放于-80℃冰箱儲存備用；采用Trizol（美國Invitrogen公司）提取總RNA，其濃度、純度采用分光光度計測定，樣品合格后采用3′→5′核糖核酸外切酶消化線性RNA分子，互補DNA進行擴增、標記（熒光），Agilent TapeStation系統進行雜交、清洗，成像通過Axon基因芯片掃描儀呈現，circRNA差異表達譜采用GenePixPro 6.0軟件分析。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測 選擇差異倍數較大的circRNA進行實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）檢驗。總RNA反轉錄獲得cDNA模板后使用qPCR儀（Applied Biosystems 7900）進行擴增，以U6作為內參，circRNA的相對表達水平以計算。引物見表1。

表1 qPCR引物

1.3 統計學處理

使用SPSS 18.0統計學軟件分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；非正態分布計量資料以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料

T1DM組患者年齡和性別分別為男14歲，男21歲，女18歲，平均糖化血紅蛋白為12.82%。對照組為性別、年齡1∶1匹配入組，糖化血紅蛋白均小于6%。

2.2 芯片檢測結果

兩組患者外周血樣本circRNA芯片的篩選，上調共5 134個，下調共5 426個；69個circRNA差異有統計學意義（P＜0.05，|logFC|＞1.5），其中64個上調，5個下調，見圖1。

圖1 1型糖尿病患者外周血環狀RNA差異表達

2.3qPCR驗證

選取|log FC|改變更為明顯的5個circRNA通過qPCR驗證發現，TIDM組與對照組相比hsa_circ_101079、 hsa_circ_100332、 hsa_circ_085129 及hsa_circ_103845表達差異均有統計學意義（P值均＜0.05），hsa_circ_006157在兩組間表達差異無統計學意義（P=0.48）。見圖2。

圖2 qPCR驗證差異表達環形RNA

3 討論

近年來，非編碼RNA在表觀遺傳學的作用越來越受到重視。在所有非編碼RNA中，長鏈非編碼RNA和microRNA等早已被人熟知。而circRNA則是全新領域，與人類疾病的發生、發展有著密切的關聯，是一種充滿前景的分子標志物和治療靶點。circRNA在各種疾病發病機制中發揮重要作用，包括癌癥、動脈粥樣硬化、骨關節炎、肺纖維化、肌強直性營養不良和阿爾茨海默病[3]。在糖尿病領域，雖然circRNA的相關研究較少，但已有讓人欣喜的收獲。Stoll等[4]發現circRNA是細胞活動的新調控因子，在糖尿病發生時參與了β細胞的功能失調。此外，circRNA cdr1as在胰島細胞功能和胰島素分泌中起著重要作用[5]。臨床研究方面，有研究通過微陣列分析比較了2型糖尿病患者和對照組受試者外周血中circRNA的表達情況，并在較大的獨立隊列中進行驗證，結果提示hsa-circ-0054633是糖尿病前期和2型糖尿病診斷的生物標志物[6]。

目前涉及T1DM的機制研究較欠缺。本研究通過circRNA芯片檢測T1DM患者和正常人群外周血circRNA表達譜，共篩選出4個目的circRNA，分別為hsa_circ_101079、hsa_circ_100332、hsa_circ_085129及hsa_circ_103845。qPCR驗證結果表明，這4個circRNA可能成為T1DM和健康個體的新生物標志物。本研究入組病例數雖較少，但診斷準確度較高。我們的研究成果與Li等[7]的研究基本一致。和目的circRNA緊密結合的miRNA與正常免疫反應和自身免疫疾病的發病機制有關[8]。例如，hsa_circRNA_100332靶向結合的hsa-miR-892a在從潛伏性結核向活動性結核的炎癥轉變期間在CD4+T細胞中下調[9]。hsa_circRNA_085129靶向的hsa-miR-145-5p通過抑制炎癥因子的分泌改善巨噬細胞的炎癥狀態[10]，被認為是多發性硬化癥的生物標志物[11]。hsa_circRNA_103845靶向的hsa-miR-127-3p屬胰島特異性miRNA，與胰島素生物合成和分泌密切相關，其能被脂多糖下調，可能參與脂多糖觸發的T1DM發展[12]。因此，我們觀察到的所有上游circRNA的上調預示著一種促炎癥狀態，這可能是T1DM病因的基礎。本研究預測胰島特異性miRNA如hsa-miR-493-5p和hsa-miR-127-3p會被抑制，這可能反映了T1DM中胰島β細胞的破壞狀態。

綜上所述，T1DM患者外周血hsa_circ_101079、hsa_circ_100332、hsa_circ_085129及hsa_circ_103845表達顯著上調，可能通過靶miRNAs調控相關信號通路參與T1DM的發生發展。