基于網絡藥理學探討附子甘草配伍治療慢性心力衰竭的作用機制*

王利勤 熊鳴峰 王騰宇 萬海同 熊墨年 吳春紅

（1南昌大學第一附屬醫院 江西南昌 330006；2南昌大學中醫十層脈研究所 江西南昌 330006；3浙江中醫藥大學 杭州 310053；4江西省中醫藥研究院 南昌 330046）

附 子（Aconitum carmichaeliDebx.）與 甘 草（Glycyrrhiza uralensisFisch）都是傳統常用中藥。附子首次出現在《神農本草經》的下品中，大毒，性熱，歸心、脾、腎經，味辛甘，主要有回陽救逆、補火助陽等功效，為“回陽救逆第一品藥”；甘草，俗稱“國老”，性平，歸心、肺、脾、胃經，味甘，主要有益氣健脾、緩急止痛、調和諸藥等功效[1]。古今醫者，一直有從事附子及其相關配伍的研究，如《醫理真傳》中指出：“附子大辛大熱，足壯先天元陽”“非附子不能挽欲絕之真陽”“能補坎中真陽，真陽為君火之種，補真火即是壯君火也”[2]。陶弘景《神農本草經集注》記載道：“俗方每用附子，皆須甘草、人參、生姜相配者，正制其毒故也。”可見附子雖藥效峻猛，但是毒性也較大，臨床上使用時需同時兼顧其毒性。我們也發現，醫者常用藥性緩和的甘草配伍附子，用甘草之緩性來減附子之毒及緩其烈性，比如經典方劑四逆湯等。而《傷寒雜病論》《金匱要略》中關于附子的臨床應用大約有60條條文，其中炙甘草與生甘草均可與附子配伍，根據需要選擇不同炮制方式的甘草，中醫四大經典中有關附子甘草配伍的條文奠定了后代附子配伍甘草作為經典藥對的基礎，并且一直被歷代中醫學者較好地應用于臨床[3]。我們知道，慢性心力衰竭（Chronic Heart Failure, CHF）是大部分常見心血管疾病的最終病理結局，也是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的最常見死因之一。在前期研究中，我們課題組發現附子甘草藥對對于CHF具有顯著的保護作用，但是基于網絡藥理學對附子甘草配伍對CHF治療作用的研究尚未見。網絡藥理學（Network Pharmacology）[4]是指通過生物信息學、高通量組學及計算生物學等多學科融合，根據中藥所具有的多組分、多靶點、機制復雜等特點，從系統生物學的角度闡述中藥、配伍以及方藥的藥理作用、治療作用靶點及相關機制的技術[5]。本研究將借助網絡模塊及基因本體論（Gene Ontology Biology Process, GO）的分析方法，較系統地闡述附子甘草配伍藥對治療CHF的機制。由于生物體內的蛋白質相互間密切合作，在機體內發揮重要作用。蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction, PPI）是許多生物過程的重要環節，而GO是目前認為對PPI的解釋較有力的方法之一[6]。本研究將應用網絡藥理學對附子甘草這一經典配伍藥對對CHF的治療作用進行探析，分析其作用機制。現報道如下：

1 材料與方法

1.1 附子、甘草主要活性成分及成分靶點的收集為了收集“附子”與“甘草”的化學成分及成分靶點，我們選取中醫藥系統內比較全面的數據庫進行搜索。其中TCMSP數據庫（http://lsp.nwsuaf.edu.cn）是一個常用的用于分析中藥成分藥理學的中醫藥數據庫，主要可用于查詢常見中藥的化學成分[7]。我們在TCMSP數據庫輸入“附子”“甘草”作為關鍵詞進行檢索，再根據該數據庫的相關搜索結果，結合其他參考文獻的研究方法[8]，并將口服利用度（Oral Bioavailability, OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness, DL）≥0.18作為篩選條件，最后篩選得到附子有效中藥成分為21個，甘草有效中藥成分為92個。為提高我們檢索結果的準確性，我們同時選用TCM數據庫（http://tcm.cmu.edu.tw/）[9]，也輸入“附子”“甘草”作為關鍵詞進一步檢索。通過將上面2個數據庫中所收集的化學成分進行整理，再輸入STITCH數據庫（https://www.stitchdata.com/），一個用于檢測已知的以及被預測的化合物和蛋白質之間相互關系的平臺，對“附子”與“甘草”化學成分的成分靶點進行歸集。

1.2 CHF的疾病靶點收集為了收集CHF的疾病靶點，我們選取用于研究人類遺傳病以及基因的知識庫OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）數據庫（http://www.Omim.org）[10]以及Gene Card（http://www.genecards.org/）數據庫。分別在這2個數據庫內以“Chronic Heart Failure”為關鍵詞進行檢索，收集與CHF相關的疾病靶點，去除重復數據后再整理所有靶點數據。

1.3 網絡構建根據收集的“附子”與“甘草”化學成分及成分靶點、慢性心力衰竭疾病靶點，再參考相關文獻中的研究方法[11]，應用生物信息分析軟件Cytoscape 3.6.1分別構建“附子”與“甘草”的成分靶點網絡、成分靶點相互作用網絡，以及CHF的疾病靶點相互作用網絡，并構建上述藥物成分靶點與疾病靶點的相互作用網絡。在構建“附子”與“甘草”成分靶點網絡時，將“1.1”整理的數據導入Cytoscape 3.6.1軟件即可得成分靶點網絡圖。在構建“附子”與“甘草”成分靶點相互作用網絡和CHF疾病靶點相互作用網絡時，我們使用用于基因網絡構建的可視化分析Bisogenet插件，將方法設置為“Input nodes and its neighbors”，參數為1，輸出方式定為基因。將構建疾病靶點網絡圖的方法設置為“Input nodes only”，通過軟件獲取“附子”“甘草”的成分靶點與CHF的疾病靶點相互作用網絡圖；再應用Bisogenet插件中的Merge功能，取得以上所獲網絡圖的交集部分為“附子”配伍“甘草”治療CHF的作用靶點候選點。

1.4 通路整合與分析將“1.3”所取的候選點制作韋恩圖并進行相關分析，了解CHF的靶點和“附子”與“甘草”潛在靶點的交集，共篩選獲得154個交點。再將所獲的靶點交集點進行GO富集分析，同時利用基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）進行相關通路注釋分析，并根據富集結果，獲得有關條形圖。相關通路的蛋白質相互作用信息可從具有檢索可能靶點預期作用的網絡數據庫STRING 9.1（http://string-db.org）中獲取[12]，篩選條件是OB≥30%，DL≥0.18。該數據庫獲取的數據可信度高，具有實時更新的功能，同時可進行信度評分。為了進一步分析藥物及疾病之間的作用靶點，我們選擇Cytoscape 3.6.1軟件中的分析聚類系數、度分布及連接組件等參數[13]，基于拓撲參數，與隨機網絡參數相比，進行網絡無標度、小范圍和模塊化等特性分析。拓撲參數信息是分析可視化合成組織與結構復雜網絡的有效信息[14]。經過以上拓撲參數信息分析，我們進一步對PPI進行模塊劃分，為了獲取更精確的靶點信息，我們設置網絡中蛋白質節點連接度的臨界值為大于3。

2 結果

2.1 相關成分、疾病靶點的收集TCMSP數據庫中的靶點附子17個，甘草92個；TCM數據庫中的靶點附子19個，甘草92個。利用STITCH數據庫對TCMSP及TCM數據庫收集所得的化合物進行成分靶點收集，發現有靶點的化合物共為81個，其中相對應的成分靶點為169個。以“Chronic Heart Failure”為關鍵詞在OMIM、Genecard這2個數據庫中進行檢索，獲得相關疾病的靶點共8 668個。疾病的靶點和藥物潛在靶點的交集有154個。見圖1。

圖1 疾病的靶點和藥物潛在靶點的韋恩圖

2.2 成分靶點與疾病靶點蛋白相互作用網絡在該網絡中，外圈分子紅色（除標注#及▲外）是來源甘草的，藍色（標注#）是附子的，黃色（標注▲）的是兩者共有的。內部的靶點紅色（除標注*外）是甘草的作用靶點，黃色（標注*）的是共有的靶點，也就是說，黃色的靶點也是附子的靶點，即甘草的靶點包含了附子的靶點。見圖2。

圖2 附子-甘草配伍藥對成分靶點和慢性心力衰竭相關靶點相互作用網絡

2.3 蛋白質與蛋白質的相互作用（PPI圖制作）首先我們將差異基因與STRING數據庫中比對，獲得差異基因的互作關系，并使用Cytoscape（http://www.cytoscape.org/）繪制相互作用網絡圖。見圖3、表1。

圖3 附子-甘草-CHF相關靶點蛋白相互作用網絡

表1 附子-甘草-CHF相關靶點蛋白相互作用網絡

2.4 計算PPI每個節點的度值對3個相互作用的網絡進行網絡合并后，共獲得節點154個，即附子-甘草對治療CHF的候選靶點共154個。見圖1。對候選靶點進行度值（Degree）評價，計算每個節點的度值，選擇結果靠前的20條。見圖4。

圖4 部分候選靶點的度值

2.5 通路整合分析將上訴數據分析結果進行GO富集分析，GO富集分析結果主要包括分子功能、生物過程及細胞組成3個部分[15]。其中，在分子功能方面，附子配伍甘草主要是通過蛋白結合、核苷酸結合等方式對CHF產生保護作用；在生物過程方面，附子配伍甘草主要是通過抗凋亡、抗氧化、抗磷酸化等過程影響CHF的治療。結果中P值越小，表明該基因在GO中富集越多。見圖5、圖6。

圖5 附子-甘草配伍藥對候選靶點的部分GO富集分析（柱狀圖）

圖6 附子-甘草配伍藥對候選靶點的部分GO富集分析（氣泡圖）

2.6 KEGG通路分析在所篩選到的前20條通路中，包含有14條疾病相關通路及5條信號通路[腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、細胞凋亡、C型凝集素受體信號通路、EGFR 酪氨酸激酶、Th17細胞分化）]。見圖7、圖8。

圖7 附子-甘草配伍藥對候選靶點的部分KEGG通路分析（柱狀圖）

圖8 附子-甘草配伍藥對候選靶點的部分KEGG通路分析（氣泡圖）

3 討論

網絡藥理學是從系統生物學和生物網絡學兩方面共同來解釋疾病發生發展過程的一種研究方法，該方法通過對中藥成分及作用靶點來探討附子配伍甘草治療CHF的可能機制。通過研究，我們發現附子-甘草配伍藥對共收集到81個化合物，對應的成分靶點為169個，同時通過對CHF的檢索得到8 668個對應靶點，通過制作韋恩圖了解到附子-甘草配伍藥對的潛在靶點與CHF的疾病靶點有154個交集。我們在對篩選的154個候選靶點進行GO與KEGG分析時發現，抗氧化過程與治療CHF的關系密切。已經有研究者發現CHF大鼠的心肌氧化損傷增加，而通過抗心肌氧化損傷可以發揮對CHF大鼠的心肌保護作用[16]。在CHF大鼠中黃嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase, XO）活性和脂質過氧化產物丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量升高，通過降低心臟XO活性及MDA含量，改善心肌水腫、壞死及纖維化損傷，改善CHF的病理變化，從而發揮抗CHF的作用[17]。同時了解到在冠心病導致的CHF患者中，ERK磷酸化水平提高，可通過抑制其磷酸化從而達到保護心肌組織、改善心功能的作用[18]。除此之外，在進行KEGG通路注釋分析時，發現TNF信號通路、細胞凋亡相關信號通路的P值較小，被顯著富集。有研究發現，TNF在缺血、缺氧等病理條件的刺激下可顯著升高，同時可通過降低TNF水平減輕心力衰竭時心肌損傷程度[19]。同時，葉超等[20]通過對CHF患者的觀察了解到對TNF的抑制明顯利于患者的恢復，表明TNF在CHF的治療中具有重要意義。

我們知道，細胞凋亡途徑在CHF的治療中也起到至關重要的作用。有研究表明，在CHF病理過程中，細胞凋亡水平明顯升高，通過降低細胞凋亡水平，可在CHF大鼠體內產生明顯的抗心衰效應，保護心肌細胞病理損傷、改善心肌細胞功能[21]。同時也有研究表明可通過調節CHF時PTEN/Akt/mTOR和ERK1/2信號通路，改善心肌細胞凋亡水平，進而發揮心肌保護作用[22]。

我們通過PPI度值的分析了解到AKT、IL-6、MAPK與CHF關系密切。眾所周知，AKT是重要的細胞因子，往往通過上游因子的調節進而對下游因子產生調節作用從而發揮作用。而Bcl2/Bax明顯受到PI3K/AKT信號通路的調節，通過降低AKT磷酸化水平抑制細胞凋亡，進而發揮抗CHF的作用[23]。同時也有研究表明，在大鼠CHF模型中，可通過激活PI3K/AKT信號通路進而發揮抗CHF的作用[24]。通過調節PTEN/Akt/mTOR信號通路可抑制細胞凋亡，進而發揮抗CHF的作用[22]。諸多研究均表明AKT在CHF的發生發展過程中起到重要作用。而白介素-6（IL-6）是體內細胞因子的重要成員，它可刺激C反應蛋白（CRP）的生成，是一種重要的炎癥介質。在心肌細胞損傷時，IL-6的表達明顯上升，而通過降低IL-6的表達，可顯著改善心肌細胞功能，從而達到保護心肌的作用[25]。而鐘鳴等[26]通過探討CHF患者血清IL-6及TNF-α水平獲悉，在CHF患者血清中IL-6和TNF-α水平明顯增高，表示在CHF的發生發展過程中IL-6和TNF-α發揮了至關重要的作用。在治療CHF的過程中，血清中TNF-α、IL-6水平在藥物的治療作用下顯著降低，說明炎癥介質TNF-α、IL-6在CHF的發生發展過程中有非常重要的作用[27]。MAPK信號通路是細胞外信號傳導的共同通路，幾乎與生物體中全部病理生理過程相關，尤其是氧化應激等細胞反應過程，在CHF模型大鼠中可見MAPK磷酸化水平升高，而抑制MAPK蛋白磷酸化，激活PPAR-γ通路，通過參與線粒體生物合成，可調節線粒體數量和質量，促進能量生成，改善心臟能量代謝，進而減緩CHF的病理進展[28]。但是也有研究表明，抑制MAPK/ERK1/2通路可能通過抑制心肌自噬過程，進而在CHF模型大鼠中發揮心肌保護作用[29]。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學的方法預測了附子-甘草治療CHF的主要機制，推斷附子-甘草配伍藥對可能通過調節AKT、MAPK相關信號通路，進而影響IL-6、TNF等細胞因子的表達，改善心肌細胞凋亡水平，從而發揮心肌保護作用。但由于所選數據庫的信息可能尚不夠完全，該研究也還存在一些局限性，需要在今后的研究中進一步闡明附子配伍甘草活性成分的作用靶點，從而更深入地探討其對CHF的作用機制。