Exendin-4對hIAPP轉基因鼠胰島功能的改善作用

劉辰 鄒慶寶 趙濟全

[摘要]目的探究Exendin-4對hIAPP轉基因鼠的保護作用及其可能的作用機制。方法正常小鼠和hIAPP轉基因鼠分別注射PBS和Exdendin-4，共分為四組：正常小鼠對照組（WT+PBS）、正常小鼠注射Exendin-4組（WT+Ex-4）、hIAPP小鼠對照組（homo+PBS）、hIAPP小鼠注射Exendin-4組（homo+Ex-4），每組6只。對四組小鼠進行2個月每天一次的腹腔注射，給藥結束后進行葡萄糖耐受實驗;體外培養Min6胰島β細胞，取對數生長期細胞分別加入2.5、5、10、20μM的hIAPP完全培養基，檢測細胞周期相關蛋白的表達;分離小鼠原代胰島細胞，AnnexinV-FITC檢測細胞凋亡;提取小鼠胰腺組織蛋白，檢測周期相關蛋白表達水平變化。結果homo+PBS組小鼠葡萄糖耐受能力顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05），hIAPP體外處理Min6細胞會劑量依賴式下調ABC蛋白及周期相關蛋白CCND2和CCND3的蛋白表達。相反，homo+Ex-4組的小鼠葡萄糖耐受能力顯著增強，差異有統計學意義（P<0.05），原代胰島細胞的凋亡比例明顯降低，細胞周期蛋白CCND2和CCND3的表達水平增加。結論Exendin-4對hIAPP轉基因鼠造成的胰島損傷具有保護作用，其機制與調控胰島細胞增殖和凋亡有關。

[關鍵詞]Exendin-4;胰島淀粉樣多肽;細胞增殖;細胞凋亡

[中圖分類號]R587.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-0616（2022）11-0027-04

2型糖尿病胰島β細胞病變的主要特點是β細胞質量和功能減退而不能分泌足夠的胰島素[1]。胰島淀粉樣蛋白沉積是導致胰島β細胞功能逐漸喪失的重要因素[2]。淀粉樣蛋白的獨特成分是胰島淀粉樣多肽（islet amyloid polypeptide，IAPP），人源胰島淀粉樣多肽（human IAPP，hIAPP）是由胰島β細胞合成的具有37個氨基酸的短肽。hIAPP的過度沉積會導致胰島β細胞的凋亡并損傷葡萄糖代謝，從而導致2型糖尿病的發生[3]。Exendin-4含有39個氨基酸殘基，屬于GLP-1受體長效激動劑。研究發現Exendin-4可以通過多種途徑改善胰島β細胞的功能，起到治療糖尿病的作用[4]。然而，這種作用是否發生在由內源性hIAPP形成的淀粉樣蛋白沉積的條件下尚不清楚，本研究旨在探討Exendin-4在體內對hIAPP轉基因鼠的保護作用及其可能的分子機制。

1材料與方法

1.1材料

hIAPP轉基因小鼠購自JacksonLab;血糖儀和血糖試紙購自三諾生物傳感公司;hIAPP購自肽谷生物科技有限公司;Exendin-4購自MCE公司;小鼠Min6胰島β細胞由本實驗室保存;胎牛血清、DMEM培養基購自Gibco公司;AnnexinV-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒購自凱基生物公司;ABC和β-catenin抗體購自CST公司;CCND2、CCDN3和CDK4購自ABclonal公司;β-Actin抗體購自Proteintech公司;PVDF膜、ECL發光液購自Millipore公司。

1.2方法

1.2.1小鼠Exendin-4處理將6～8周齡雄性小鼠分為四組：正常小鼠對照組（WT+PBS）、正常小鼠注射Exendin-4組（WT+Ex-4）、hIAPP轉基因小鼠對照組（homo+PBS）、hIAPP轉基因小鼠注射Exendin-4組（homo+Ex-4）。Exendin-4按照10nmol/kg的劑量給藥。對四組小鼠進行2個月每天一次的腹腔注射，給藥結束后進行葡萄糖耐受實驗（oral glucose tolerancetest，OGTT）。

1.2.2小鼠葡萄糖耐受實驗實驗前先將小鼠禁食16h，而后檢測小鼠血糖水平作為起始血糖值，然后，對小鼠按照2g/kg體重的標準進行葡萄糖腹腔注射，分別在30、60、120min尾靜脈取血測定血糖水平。

1.2.3小鼠胰腺組織取材每組取3只小鼠用3%的戊巴比妥鈉麻醉后，打開胸腔，將灌流針刺入心尖，先用生理鹽水進行沖洗，然后灌注4%的多聚甲醛，當肝臟發白時灌流結束。迅速摘取胰腺組織于-80°C保存，用于蛋白檢測。

1.2.4小鼠原代胰島細胞分離每組取3只小鼠頸椎脫臼處死后用酒精浸泡消毒。在生物安全柜中打開腹腔，十二指腸的開口處灌注Hank’s鹽，當胰腺膨脹后，摘除胰腺組織裝入盛有預冷Hank’s鹽的平皿中，剪成1～3mm的小塊，在37°C培養箱中消化15min后加入預冷Hank’s鹽中止消化，1500r/min室溫離心3min洗滌3次，用PBS重懸后置于冰上用于后續流式細胞儀檢測。

1.2.5Annexin V-FITC檢測細胞凋亡將分離好的小鼠胰島細胞加入5μl Annexin-V-FITC和10μl碘化丙啶（PI）試劑，室溫避光孵育20min，隨后立即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶（PI）為紅色熒光。

1.2.6Westernblot檢測相關蛋白表達RIPA裂解液裂解細胞，BCA法進行蛋白定量。SDS-PAGE凝膠電泳進行蛋白分離，半干法轉運至PVDF膜，室溫封閉1h，加入一抗抗體4°C孵育過夜。TBST洗滌后，二抗室溫孵育1h，加入ECL發光液，使用天能成像系統進行檢測。

1.3統計學方法

采用SPSS19.0統計學軟件進行數據處理，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1Exendin-4提高hIAPP小鼠的葡萄糖耐受能力

腹腔注射葡萄糖后，各組小鼠的血糖水平均升高。相比WT+PBS組，homo+PBS組上升更為顯著，差異有統計學意義（P<0.05），而homo+Ex-4組血糖水平相比homo+PBS組明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），隨著時間的增加，WT+PBS組的血糖幾乎恢復到正常水平，而homo+PBS組仍較高，homo+Ex-4組血糖水平迅速下降。見表1。

2.2hIAPP抑制胰島β細胞周期相關蛋白的表達

不同濃度的hIAPP體外刺激小鼠Min6胰島β細胞48h。Western blot結果顯示，hIAPP可以明顯抑制ABC、CCND2以及CCND3的蛋白表達，并且呈現劑量依賴，而CDK4和β-catenin的蛋白表達水平無明顯變化，見圖1。

2.3Exendin-4抑制hIAPP轉基因小鼠的胰島細胞凋亡

小鼠原代胰島細胞凋亡分析結果顯示，相比于WT+PBS組（1.43%），homo+PBS組的早期凋亡細胞數明顯增加（21.3%），而homo+Ex-4組可以明顯降低由hIAPP導致的原代胰島細胞凋亡比例（9.76%），WT+Ex-4組無明顯變化，見圖2。

2.4Exendin-4促進hIAPP轉基因小鼠的胰島細胞周期相關蛋白表達

小鼠原代胰腺細胞Western blot結果顯示，homo+PBS小鼠原代胰島細胞中CCND2和CCND3的蛋白表達顯著降低，而Exendin-4可以逆轉由hIAPP導致的CCND2和CCND3的降低，見圖3。

3討論

2型糖尿病的主要特征是胰島β細胞的功能下降所引起的慢性高血糖，通常伴有胰島素敏感性降低[5-6]。盡管β細胞的功能改變在糖尿病的發病中起到關鍵作用，但β細胞數量的減少同樣對糖尿病的病理進展具有重要影響[7]。與非糖尿病患者相比，2型糖尿病患者體內β細胞數量減少了40%～65%[8]。目前認為增殖能力降低且凋亡增多是造成β細胞數量減少的主要因素。在2型糖尿病患者的胰島組織中發現有大量的淀粉樣蛋白沉積，經鑒定發現其主要成分是IAPP[9]。胰島周圍高濃度的IAPP通過形成大量淀粉樣沉積導致β細胞的功能紊亂[2]。在動物模型中，過表達hIAPP能夠顯著增加淀粉樣蛋白沉積，導致β細胞功能障礙和凋亡[10-11]。本研究發現，hIAPP轉基因小鼠的葡萄糖耐受能力明顯減弱，表現出了糖尿病癥狀。

Exendin-4是一種葡萄糖濃度依賴性促胰島素分泌劑，可通過促進胰島β細胞的增殖、調控細胞自噬以及抑制細胞凋亡來改善胰島的功能[4，12]。但是Exendin-4是否在體內對hIAPP轉基因鼠具有保護作用尚缺乏研究。在本研究中，體內注射Exendin-4可以明顯增強hIAPP轉基因小鼠的葡萄糖耐受能力，提示Exendin-4具有改善IAPP誘導的細胞凋亡作用。

細胞周期是在眾多蛋白分子調控下最終產生兩個新的子細胞的過程[13]，細胞周期蛋白（cyclin）通過與細胞周期依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）相互協作，共同維持和協調細胞周期的運行[14-15]，細胞周期的正常運轉對于維持細胞數量和功能至關重要[16]。在本研究中，hIAPP在體外會明顯抑制小鼠β細胞中細胞周期相關蛋白CCND2和CCND3的表達，而對細胞周期依賴性激酶CCRK和CDK4無影響。在hIAPP轉基因小鼠原代胰島細胞檢測中發現，體內注射Exendin-4可以有效逆轉由hIAPP導致的周期蛋白CCND2和CCND3的表達丟失，提示Exendin-4可以促進體內胰島細胞增殖。另外，本研究還發現，hIAPP轉基因小鼠的胰島組織中凋亡細胞比例明顯增加，而Exendin-4處理組細胞凋亡比例顯著降低，說明Exendin-4具有抑制胰島細胞凋亡的功能。

綜上所述，Exendin-4可以恢復hIAPP轉基因小鼠的胰島功能，其作用機制可能與Exendin-4促進小鼠體內胰島細胞增殖并且抑制胰島細胞凋亡有關。本研究為Exendin-4的臨床應用提供了新的理論指導。

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（收稿日期：2021-12-23）