TGF-β1基因缺失對UVB輻射后小鼠皮膚損傷的影響

張穎 賀芳 葉蓓 李杰 陳建珍

[摘要]目的觀察轉化生長因子β1（TGF-β1）基因缺失后中波紫外（UVB）輻射對皮膚組織的影響。方法制備TGF-β1基因缺失小鼠，使用UVB輻射制備皮膚損傷模型。實驗分組為野生型設為對照組（Con組），野生型給予UVB照射設為Con+UVB組，TGF-β1-/-給予UVB照射設為TGF-β1-組。根據是否給予野生型小鼠TGF-β1注射，分為TGF-β1注射組TGF-β1（+）和TGF-β1不注射組TGF-β1（-）。分別觀察小鼠皮膚損傷部位Smad3、基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）、基質金屬蛋白酶-3（MMP-3）、I型膠原及III型膠原的mRNA表達情況，觀察小鼠血清中類胰島素生長因子-1（IGF-1）、血管內皮生長因子（VEGF）以及角質細胞生長因子（KGF）的含量。同時給UVB輻射皮膚損傷的野生型小鼠注射TGF-β1，觀察MMP-1、MMP-3、I型膠原及III型膠原的mRNA表達情況，及血清中IGF-1、VEGF、KGF的含量。結果Con+UVB組Smad3表達和I型膠原及III型膠原含量低于Con組，血清中IGF-1、VEGF以及KGF含量低于Con組，而MMP-1和MMP-3的表達高于Con組，差異有統計學意義（P<0.05）;TGF-β1-組Smad3表達和I型膠原及III型膠原含量低于Con+UVB組，血清中IGF-1、VEGF以及KGF含量低于Con+UVB組，而MMP-1和MMP-3的表達高于Con+UVB組，差異有統計學意義（P<0.05）;TGF-β1（+）組I型膠原及III型膠原含量高于TGF-β1（-）組，血清中IGF-1、VEGF以及KGF含量高于TGF-β1（-）組，而MMP-1和MMP-3的表達低于TGF-β1（-）組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論TGF-β1基因缺失會加劇UVB輻射對皮膚的損傷，給予TGF-β1補充可減少UVB輻射對皮膚的損傷。

[關鍵詞]TGF-β1;中波紫外;皮膚損傷;Smad3;I型膠原

[中圖分類號]R818

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-0616（2022）11-0031-05

紫外（ultraviolet，UV）輻射會引起皮膚損傷和老化，甚至誘發皮膚癌[1-2]。UV根據其波長的不同分為UVA、UVB以及UBC，而UVB被認為是誘導光老化的主要原因。UVB可誘發皮膚基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）和基質金屬蛋白酶-3（MMP-3）的表達上升，從而抑制皮膚膠原纖維的合成[3-4]。轉化生長因子β1（TGF-β1）可以作用于下游的Smad3，促進Smad3的表達上調，從而抑制MMP-1和MMP-3，促進膠原纖維對損傷皮膚的修復[5-7]。同時，TGF-β1還可促進體內其他修復因子表達的上調，從而促進皮膚修復。本研究構建了TGF-β1基因缺失的小鼠，通過給予小鼠UVB輻射，觀察TGF-β1在UVB輻射后小鼠皮膚損傷及修復中的作用，為下一步臨床使用TGF-β1治療UVB輻射致皮膚損傷提供理論依據。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物及分組選擇TGF-β1雜合子小鼠雌雄交配，取同窩子代野生型和TGF-β1-/-小鼠用于實驗研究。6～8周齡時，選擇同窩雄性小鼠，其中野生型設為對照組（Con組），野生型給予UVB照射設為Con+UVB組，TGF-β1-/-給予UVB照射設為TGF-β1-組。根據是否給予野生型小鼠TGF-β1注射，分為TGF-β1注射組TGF-β1（+）和TGF-β1不注射組TGF-β1（-）。1.1.2實驗試劑TGF-β1、類胰島素生長因子-1（IGF-1）、血管內皮生長因子（VEGF）以及角質細胞生長因子（KGF）酶聯免疫分析試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司;轉化生長因子β1抗體購自Abcam;轉化生長因子β1樣品購自Peprotech;qPCR反應試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2實驗方法

1.2.1模型建立選擇小鼠背部同一區域進行脫毛，面積為3.0cm×3.0cm。使用UVB紫外光源對小鼠背部脫毛區域進行照射，輻照強度為0.17mW/cm2，連續照射7d，每次照射30min。對于需要注射TGF-β1的小鼠，TGF-β1（+）組與TGF-β1（-）組均給予上述UVB輻射，TGF-β1（+）組每日腹腔給予1ml濃度為1.0ng/ml的TGF-β1，而TGF-β1（-）則給予同等體積的PBS。照射第7天后進行拍照，觀察輻射區域皮膚。

1.2.2WesternBlot檢測將小鼠背部輻射區域皮膚組織提取后在4%多聚甲醛中固定組織標本并過夜。對皮膚組織進行稱重，使用試劑盒進行總蛋白提取，使用含10%蛋白酶抑制劑的RIPA覆蓋細胞然后使其裂解，測蛋白質濃度。使用SDS-PAGE將蛋白質轉移到PVDF膜上，孵育TGF-β1一抗過夜，孵育二抗2h。

1.2.3ElISA檢測于造模成功后即刻由小鼠尾靜脈取血，使用TGF-β1、IGF-1、VEGF以及KGF的ELISA檢測試劑盒對血液樣本進行檢測，操作步驟嚴格按照試劑盒操作說明進行。1.2.4實時熒光定量PCR（RT-qPCR）將小鼠背部輻射區域皮膚組織提取后在4%多聚甲醛中固定組織標本并過夜。根據操作說明提取總RNA，逆轉錄為cDNA及PT-qPCR反應嚴格按照操作說明進行。Smad3、MMP-1、MMP-3、I型膠原、III型膠原以及內參GAPDH的引物設計見表1。

1.2.5HE染色獲得皮膚組織后，在4%多聚甲醛中固定24h。根據HE染色制備要求制備切片，切片厚度為5μm。

1.3統計學分析

所有數據采用SPSS17.0統計學軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩獨立樣本均數比較，呈正態分布的采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1TGF-β1基因缺失小鼠的鑒定

通過WesternBlot檢測發現，TGF-β1-組小鼠的TGF-β1蛋白表達明顯低于Con組（圖1A）。使用ElISA檢測發現，TGF-β1-小鼠血清中TGF-β1含量極低，且顯著低于Con組（圖1B），差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2小鼠UVB輻射區域病理觀察

通過HE染色發現（圖2），Con組小鼠背部皮膚角質層厚度明顯薄于TGF-β1-組以及Con+UVB組。同時，TGF-β1-組皮下可觀察到更多的炎性細胞的浸潤，而Con+UVB組炎性細胞浸潤程度介于Con組與TGF-β1-組之間。

2.3UVB輻射對小鼠Smad3表達的影響

通過RT-qPCR比較Smad3的mRNA表達。TGF-β1-組、Con+UVB組Smad3的mRNA表達明顯低于Con組，差異有統計學意義（P<0.05）;TGF-β1-組明顯低于Con+UVB組（P<0.05）。見圖3。

2.4UVB輻射對小鼠MMP-1和MMP-3表達的影響

TGF-β1-組、Con+UVB組MMP-1和MMP-3的mRNA表達明顯高于Con組，差異有統計學意義（P<0.05）;TGF-β1-組兩者表達均高于Con+UVB

組（P<0.05）。見圖3。

2.5UVB輻射對小鼠背部膠原纖維表達的影響

I型膠原和III型膠原的mRNA表達最高的為Con組，其次為Con+UVB組，最低的為TGF-β1-組（P<0.05）。見圖4。

2.6UVB輻射對小鼠血清修復因子含量的影響

TGF-β1-組、Con+UVB組IGF-1、VEGF以及KGF的血清含量明顯低于Con組，差異有統計學意義（P<0.05）;TGF-β1-組IGF-1、VEGF以及KGF的血清含量明顯低于Con+UVB組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖5。

2.7TGF-β1對UVB輻射后小鼠皮膚的改善作用

為進一步明確TGF-β1在UVB輻射后小鼠皮膚中的作用，通過給小鼠注射TGF-β1對其進行觀察。由圖6A可發現，給予TGF-β1注射后，小鼠血清中修復因子IGF-1、VEGF以及KGF的含量明顯上升，差異有統計學意義（P<0.05）;由圖6B可發現，小鼠背部皮膚MMP-1和MMP-3的mRNA表達明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）;由圖6C可發現，輻射部位I型膠原和III型膠原的mRNA表達明顯上升（P<0.05）。

3討論

當前，隨著我國人口老齡化以及人們對美的追求不斷加深，皮膚光老化越來越受到人們的關注。當人體皮膚暴露于UVB輻射環境中時，皮膚組織會產生過量的活性氧自由基（ROS）[8]，ROS會進一步誘導AP-1表達上調，隨后使得MMP-1和MMP-3的表達升高[9-10]。MMP-1和MMP-3使得細胞外基質降解，膠原合成能力下降，因此皮膚的愈合能力會降低[11-12]。

本研究通過制造TGF-β1基因缺失模型小鼠，觀察TGF-β1在UVB致皮膚損傷中的作用。本研究結果發現，UVB可使大鼠皮膚組織中的Smad3表達下調，從而使MMP-1和MMP-3表達上升，進一步導致膠原合成減少。而對TGF-β1基因缺失模型的小鼠，UVB作用的效果越發顯著。當前，已有文獻明確TGF-β1發揮作用是通過其下游的Smad3。因此，本研究證實了UVB致皮膚損傷的通路可能為UVB/TGF-β1/Smad3/MMPs/膠原纖維信號軸。TGF-β1在機體的含量與其他修復因子的表達也有一定關系[13-15]。在本研究中，TGF-β1基因缺失小鼠體內IGF-1、VEGF以及KGF的含量要低于野生小鼠。因此本研究認為上述促修復因子含量的降低也是導致皮膚損傷后恢復緩慢的原因之一，如果輻射環境一直存在，將會進一步導致皮膚損傷的加劇。

通過使用TGF-β1基因缺失模型小鼠可發現TGF-β1基因缺失后UVB致皮膚損傷的程度會更加嚴重。為進一步明確TGF-β1在其中的作用，本研究給野生型小鼠補充TGF-β1，發現得到補充后的小鼠血清中IGF-1、VEGF以及KGF含量均提高，MMP-1和MMP-3表達均下降，膠原合成能力提高。因此本研究認為TGF-β1可有效幫助治療UVB輻射導致的皮膚損傷。

綜上所述，TGF-β1基因缺失后UVB輻射會導致皮膚損傷的加劇，這可能與一系列反應致膠原合成減少有關，也可能與機體一些促修復因子表達下降有關。而給予補充TGF-β1后，UVB輻射導致的皮膚損傷程度會降低。

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（收稿日期：2021-07-16）