金櫻子總黃酮對糖尿病性白內障模型大鼠眼晶狀體的保護作用及機制研究

陳麗華 李靄燕 吳小桃 凌梓韻

[摘要]目的探究金櫻子總黃酮對糖尿病性白內障（DC）模型大鼠眼晶狀體的保護作用，并分析其可能作用機制。方法選擇90只無特定病原體（SPF）級的斯潑累格·多雷（SD）大鼠，隨機分為正常對照組、模型組、金櫻子黃酮低劑量組、金櫻子黃酮中劑量組、金櫻子黃酮高劑量組，每組各18只。其中，正常對照組予以普通飼料飼養和自由飲水，其余四組應用小劑量鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射加膳食誘導構建DC大鼠模型，且金櫻子黃酮低劑量組、金櫻子黃酮中劑量組、金櫻子黃酮高劑量組分別灌胃40、80、160mg/kg金櫻子總黃酮，實驗觀察8周，比較各組大鼠晶狀體混濁程度以及晶狀體超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平的差異。結果與正常對照組比較，模型組大鼠晶狀體混濁程度顯著升高，晶狀體SOD、GSH-Px表達水平更低，MDA表達水平更高，差異有統計學意義（P<0.05）。金櫻子黃酮低劑量組、金櫻子黃酮中劑量組、金櫻子黃酮高劑量組大鼠的晶狀體混濁程度顯著低于模型組，且晶狀體SOD、GSH-Px表達水平明顯高于模型組，MDA水平明顯低于模型組（P<0.05）。結論金櫻子總黃酮能夠改善DC模型大鼠眼晶狀體的混濁程度，對晶狀體有良好的保護作用，其機制可能與提高大鼠眼晶狀體抗氧化能力有關。

[關鍵詞]糖尿病性白內障大鼠;金櫻子總黃酮;晶狀體;抗氧化能力

[中圖分類號]R285.5;R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-0616（2022）11-0080-04

糖尿病性白內障（diabetic cataract，DC）為糖尿病的常見眼部慢性并發癥，是糖尿病患者視力降低的主要原因之一。當前在臨床上手術雖為DC治療的重要手段，但部分患者受自身健康狀況影響不能耐受手術，只能通過藥物控制病情[1]。因此積極探索DC的發生機制，選擇有效的藥物延緩DC發展是當前眼科研究的熱門課題。近年隨著中藥現代化研究與推進，越來越多研究發現從金櫻子中提取的金櫻子總黃酮有清除自由基、抗氧化、抗炎、防治心腦血管疾病等多種作用，也逐漸應用于糖尿病及其并發癥治療中[2-3]，但關于金櫻子總黃酮對DC的影響及作用機制當前尚未明確。為此，本研究應用小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射加膳食誘導構建DC大鼠模型，并觀察金櫻子總黃酮對DC模型大鼠晶狀體混濁程度及氧化應激指標的影響，為尋找DC治療新藥物提供一定的實驗依據。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物選擇90只無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級的斯潑累格·多雷（Sprague-Dawley，SD）大鼠（雌雄各半），體重250～280g，均在廣州中醫藥大學實驗動物中心飼養，且在入組實驗時取大鼠尾靜脈血液檢測血糖<6.7mmol/L，經托吡卡胺散瞳裂隙燈檢查證實其晶狀體透明。應用隨機抽簽法將上述90只大鼠隨機分為正常對照組、模型組、金櫻子黃酮低劑量組、金櫻子黃酮中劑量組、金櫻子黃酮高劑量組，每組各18只。

1.1.2藥物與試劑金櫻子浸膏（金櫻子濃縮液，濃縮倍數1.1～1.3）購自西安斯諾特生物技術有限公司;鏈脲佐菌素（美國sigma公司，產品編號ST1668-1g，純度≥98%）;超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒均購于深圳子科生物科技有限公司。

1.1.3實驗儀器瑞宇SLM-K1裂隙燈顯微鏡;德國羅氏血糖儀;德科H0503精密電子天平;上海繼譜UV-1600紫外線分光光度計。

1.2方法

1.2.1金櫻子總黃酮的制備稱取500g金櫻子浸膏進行真空干燥以取得金櫻子提取粗品，加水溶解過濾后，用AB-8型大孔吸附樹脂分離濾液，并用乙醇洗脫濾液，再進行減壓蒸餾以將其制成濃縮液。然后，用聚酰胺樹脂分離濃縮液，依次進行乙醇洗脫→減壓蒸餾→加入分離純化劑→過濾→冷凍干燥，制得金櫻子提取物精制品。隨后應用紫外分光光度法，以蘆丁作為對照品測定金櫻子提取物總黃酮的含量是81.21%。

1.2.2構建DC大鼠模型模型組、金櫻子黃酮低劑量組、金櫻子黃酮中劑量組、金櫻子黃酮高劑量組建立DC大鼠模型，具體方法：各組大鼠均適應性喂養3d，自由飲食飲水，再在大鼠腹腔注射65mg/kg鏈脲佐菌素，每日取大鼠尾靜脈血監測其空腹血糖水平，當其空腹血糖>16.7mmol/L提示糖尿病大鼠模型建模成功。然后每日對糖尿病大鼠模型雙眼滴1%托品酰胺滴眼液，1周后用乙醚蒸氣麻醉大鼠，通過裂隙燈觀察大鼠晶狀體，晶狀體出現混濁可判斷為DC建模成功，若大鼠未出現混濁繼續應用托品酰胺滴眼液。在建模期間各組大鼠自由飲食水。1.2.3干預方法金櫻子黃酮低劑量組、金櫻子黃酮中劑量組、金櫻子黃酮高劑量組分別每日灌胃40、80、160mg/kg金櫻子總黃酮，正常對照組每日灌胃等容量的生理鹽水。五組均實驗觀察8周。

1.3觀察指標及評價標準

1實驗觀察8周后，應用裂隙燈觀察大鼠晶狀體變化情況，并進行組間晶狀體混濁度比較。晶狀體混濁度分級標準[4]：0期，晶狀體透明;1期，晶狀體輕度混濁，四周見有少許囊泡，但瞳孔仍透明;2期，晶狀體中度混濁，周圍囊泡數量增多，呈融合狀，且有少量囊泡擴展到瞳孔;3期，晶狀體高度混濁，瞳孔區內有大量囊泡，晶狀體核混濁明顯加重;4期，晶狀體完全混濁。2比較各組大鼠晶狀體SOD、MDA、GSH-Px水平。采用頸椎脫臼法處死實驗大鼠，取晶狀體用生理鹽水反復沖洗吸干水分待檢，SOD采用鄰苯酚自氧化法測定，MDA采用硫代巴比妥酸法測定，GSH-Px采用改良Hafeman法測定。

1.4統計學處理

采用SPSS20.0統計學軟件處理數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較行單因素方差分析;計數資料以[n（%）]表示，等級資料行秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組大鼠晶狀體混濁程度比較

實驗結束時，正常對照組大鼠的晶狀體均完全透明。而金櫻子黃酮低劑量組、金櫻子黃酮中劑量組、金櫻子黃酮高劑量組大鼠的晶狀體混濁程度顯著低于模型組，且隨著金櫻子總黃酮劑量增加，晶狀體混濁程度逐漸降低，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2各組大鼠晶狀體SOD、MDA、GSH-Px水平比較

與正常對照組比較，模型組晶狀體SOD、GSH-Px表達水平更低，MDA表達水平更高，差異有統計學意義（P<0.05）。金櫻子黃酮低劑量組、金櫻子黃酮中劑量組、金櫻子黃酮高劑量組大鼠晶狀體SOD、GSH-Px、MDA水平比較，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

3討論

當前在臨床上DC的發生機制尚無確切的說法，研究主要集中在三個方面，分別是氧化應激機制的激活[5]、多元醇途徑[6]、晶狀體蛋白非酶糖基化[7]。有學者發現[8]，氧化應激是其他兩個理論的重要中間環節，并能夠進一步介導晶狀體上皮細胞凋亡。正常人晶狀體內存有一定數量自由基，并存有兩大抗氧化體系，分別以酶促和非酶促反應為特點，其中包括SOD、GSH等，使晶狀體組織活性氧及自由基的產生和清除保持動態平衡，以免自由基的損傷。然而在外界誘發因素作用下，自由基生成會逐漸變多，抗氧化防御系統會受到抑制，致使氧化應激反應損傷加劇，損害晶狀體上皮細胞，晶狀體內蛋白成分比例失調，表現為不可溶性蛋白比例增多，最終促使白內障發生發展。因此，抑制氧自由基，抗晶狀體氧化損傷是當前研究DC的突破口。

SOD可特異性地與超氧化物陰離子結合引發歧化反應，進而發揮清除氧自由基的作用，避免機體受到自由基的損害[9]。GSH-Px能夠分解體內過氧化氫，還原氫氧化物，抑制機體氧化反應[10]。MDA是機體內脂質過氧化物降解的產物，故SOD、GSH-Px用于反映機體抗氧化能力，MDA用于反映機體氧化應激損傷程度[11]。本研究結果顯示，模型組大鼠的晶狀體混濁程度顯著高于正常對照組，且模型組大鼠晶狀體SOD、GSH-Px表達水平更低，MDA表達水平更高，說明DC大鼠晶狀體抗氧化能力顯著降低，存有氧化應激受損，這可能是體內過多氧自由基誘發過氧化損傷，造成實驗大鼠晶狀體MDA含量增加，晶狀體可溶性蛋白減少，不可溶性蛋白變多，影響晶狀體膜的通透性，促使晶狀體光學性質、內環境變化，逐漸引起晶狀體混濁[12-13]。

本研究應用金櫻子總黃酮干預DC大鼠，結果顯示金櫻子黃酮組的晶狀體混濁程度顯著低于模型組，晶狀體SOD、MDA、GSH-Px水平優于模型組，且隨著總黃酮劑量增加，其晶狀體改善效果更好，與周小平等[14]研究結果相似，說明金櫻子總黃酮能夠通過增加抗氧化酶的活性抑制自由基產生，阻止氧自由基擠入晶狀體，進而減輕氧化應激損傷，延緩DC大鼠晶狀體囊泡形成，防止DC發生發展，而且其作用隨著劑量增長而加強[15]。現代藥理學也報道[16]，金櫻子中富含黃酮、多糖、皂苷、鞣質等活性物質，其中金櫻子黃酮具有抗氧化、增強免疫、抗菌和降血脂作用，但其具體分子作用機制、生物學意義尚未清楚，有待研究。而且本研究也有不足之處，未對不同劑量金櫻子總黃酮的安全性進行研究，故今后需增加觀察指標，進行更高水平層次探討金櫻子總黃酮對DC模型大鼠晶狀體保護作用的量效關系，為臨床推廣應用提供高質量循證醫學證據。

綜上所述，金櫻子黃酮能夠改善DC模型大鼠眼晶狀體的混濁程度，對晶狀體有良好的保護作用，且其保護作用呈劑量依賴性，其機制可能與提高大鼠眼晶狀體抗氧化能力有關。

[參考文獻]

[1]李朝輝，馬天駒，葉子.重視合并糖尿病的白內障患者管理[J].中華眼科雜志，2020，56（5）：325-329.

[2]劉金安，劉相文，耿巧玉，等.金櫻子不同提取方法提取物體外抑制病毒活性及機制研究[J].西部中醫藥，2020，33（1）：9-12.

[3]蔣德旗，蔣夏榮，夏家朗，等.復合酶提取金櫻子根多糖工藝的優化及其抗氧化活性[J].中成藥，2018，40（11）：2421-2425.

[4]王曉明，湯欣.晶狀體功能失調指數在年齡相關性白內障診斷及手術中的應用[J].中華實驗眼科雜志，2018，36（3）：199-203.

[5]蘇梅貴，羅向霞.中醫藥基于氧化應激途徑防治糖尿病視網膜病變的機制進展[J].中國中醫眼科雜志，2020，30（11）：821-824，836.

[6]韓雪，蘇勝，田霈，等.醛糖還原酶在糖尿病性白內障中的作用[J].現代生物醫學進展，2015，15（7）：1362-1364.

[7]羅云娜，趙海霞，張伊暉，等.TGF-β1、IGF-1、bFGF和IL-6在糖尿病性白內障中的表達及意義[J].內蒙古醫科大學學報，2020，42（3）：225-228，238.

[8]陳艷文.糖尿病性白內障患者血清與房水中細胞因子表達的變化[J].國際眼科雜志，2020，20（11）：1946-1949.

[9]劉麗，艾華，康前雁，等.不同劑量白藜蘆醇對糖尿病性白內障大鼠晶狀體抗氧化酶活力的影響[J].現代生物醫學進展，2019，19（24）：4642-4645.

[10]吳群，郝麗麗，陶雯璇，等.糖尿病型白內障患者血清和房水中部分抗氧化指標及血管內皮生長因子水平[J].貴州醫科大學學報，2017，42（11）：1302-1305.

[11]舒暢，范強，楊麗霞，等.昆侖雪菊提取物對STZ誘導糖尿病大鼠血清SOD、MDA、GSH-PX的影響[J].中醫研究，2017，30（4）：70-72.

[12]李曉，劉雪薇，蘆凌羽，等.氧化應激與糖尿病相關性白內障的研究進展[J].西北國防醫學雜志，2020，41（7）：457-462.

[13]張劍，趙燕.葛根素對大鼠糖尿病性白內障的抗氧化損傷作用及機制[J].中國老年學雜志，2018，38（8）：1932-1934.

[14]周小平，周俊，肖啟國，等.金櫻子滴眼液抑制糖尿病大鼠白內障的機制研究[J].世界臨床醫學，2017，11（15）：1-2.

[15]周俊，何湘珍，肖啟國.金櫻子通過增加Bcl-2/Bax表達比抑制大鼠糖尿病性白內障晶狀體上皮細胞的凋亡[J].眼科新進展，2014，34（4）：314-318.

[16]王燕，朱向東，王歡，等.金櫻子的臨床應用及其用量探究[J].吉林中醫藥，2020，40（6）：806-808.

（收稿日期：2021-09-24）