Beclin-1、Bax及周期蛋白依賴性激酶4蛋白在子宮內膜癌中的表達及其臨床意義

謝田鳳 楊進瓊 陳秀芬

[摘要]目的探討Beclin-1、Bax及周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）蛋白在子宮內膜癌（EC）中的表達及其臨床意義。方法選取高州市人民醫院2019年1月至2021年6月收治的42例EC患者作為觀察組，選取同期高州市人民醫院58例子宮肌瘤患者作為對照組，兩組患者均進行子宮切除術，獲取兩組病灶組織標本，采用Westernblot法檢測并比較兩組患者病灶組織Beclin-1、Bax、CDK4蛋白相對表達量，分析Beclin-1、Bax、CDK4在不同病理特征EC患者中表達的差異情況。結果觀察組的CDK4表達水平高于對照組，觀察組的Bax及Beclin-1水平低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。低、未分化程度、FIGO分期III～IV期、有淋巴結轉移、肌層浸潤≥1/2患者的CDK4表達水平高于中、高分化程度、FIGO分期I～II期、無淋巴結轉移、肌層浸潤<1/2的患者，低、未分化程度、FIGO分期III～IV期、有淋巴結轉移、肌層浸潤≥1/2患者中Beclin-1及Bax表達水平低于中、高分化程度、FIGO分期I～II期、無淋巴結轉移、肌層浸潤<1/2的患者，差異有統計學意義（P<0.05）。結論EC患者病灶組織的Beclin-1、Bax及CDK4與子宮肌瘤患者存在明顯差異，Beclin-1、Bax及CDK4可作為評估EC患者預后的指標。

[關鍵詞]Beclin-1;Bax;周期蛋白依賴性激酶;子宮內膜癌

[中圖分類號]R737.33

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-0616（2022）11-0147-04

子宮內膜癌（endometrial cancer，EC）是一種起源于子宮內膜上皮的惡性腫瘤，目前研究顯示[1]，EC占女性生殖系統惡性腫瘤患者總數的20%～30%，且發病率呈逐年上升及年輕化的趨勢，對我國女性生命健康構成嚴重威脅。目前主要采用手術治療EC，但部分患者術后復發且復發患者生存期較短，對EC進行早期診斷及干預具有重要意義。隨著分子醫學的不斷發展，目前發現在EC患者中存在多種因子的異常表達，其中Beclin-1、Bax及周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinases，CDK4）屬于凋亡基因編碼蛋白家族成員[2]，通過促進腫瘤細胞增殖、參與細胞自噬過程及腫瘤細胞凋亡抑制等在腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用。本研究中對EC患者的Beclin-1、Bax及CDK4的相對表達水平進行檢測，分析其在子宮內膜惡性腫瘤及良性腫瘤中的差異情況，同時分析其在惡性腫瘤患者中表達的差異情況，為臨床提供參考。

1資料與方法

1.1一般資料

選取高州市人民醫院（我院）2019年1月至2021年6月收治的42例EC患者作為觀察組，選取同期我院收治的58例子宮肌瘤患者作為對照組，觀察組年齡32～68歲，平均（47.6±3.5）歲;體重指數（body mass index，BMI）18.21～28.54kg/m2，平均（21.75±1.06）kg/m2;分化程度：低、未分化21例，中分化11例，高分化10例;病理分期：I～II期35例，III～IV期7例，子宮內膜厚度4～24mm，平均（16.21±2.35）mm。對照組年齡31～67歲，平均（47.2±3.0）歲;BMI17.52～29.56kg/m2，平均（21.60±1.04）kg/m2。兩組患者一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

納入標準：1經我院影像科、病理科檢查，確診為EC或子宮肌瘤，其中子宮肌瘤患者子宮內膜組織正常;2擬行腹腔鏡下子宮全切術治療。排除標準：1合并心、肝、腎等重要臟器功能障礙者;2合并神經系統、內分泌系統、消化系統嚴重疾病者;3入組前接受過放化療治療者。

1.2方法

留取兩組患者術中病灶組織送病理學檢查，加入RIPA裂解液后進行充分勻漿，勻漿次數15次，勻漿時間為30min，獲取勻漿懸浮液，置于新型單溫區冷藏冷凍設備（北京福意電器有限公司，型號：FYL-YS-129A型），在4°C的條件下保存1h。使用離心機（美國貝克曼公司，型號：OptimaMAX-TL型）離心10min，離心速度為15000r/min，離心半徑為15cm，提取上清液，獲取總蛋白。行SDS-PAGE電泳、轉印，先使用70V恒壓進行分離膠后調至100V，使用濕轉移法轉移蛋白，使用280mA恒定電流轉模50min，脫脂奶粉（加入1×TBST10ml與0.5g脫脂牛奶干粉進行震蕩充分溶解）進行封閉，封閉條件：37°C，1h，而后使用PBST洗膜3次，10min/次;加入兔抗Bax（稀釋濃度1∶2000，上海信裕生物科技有限公司）、羊抗Beclin-1（稀釋濃度1∶2000，上海信裕生物科技有限公司）及兔抗Bax（稀釋濃度1∶1000，上海信裕生物科技有限公司），置于4°C保存箱，使用Fast Blocking Western封閉液（購自翌圣生物科技公司）過夜孵育，而后使用PBST洗膜3次，10min/次。加入羊抗兔二抗（稀釋濃度1∶2000，上海信裕生物科技有限公司）置于室溫下進行2h孵育，而后采用ECL顯色（顯色液以過氧化氫與魯米諾按1∶1比例配制）。條帶的光密度值采用ImageJ1.8.0軟件半定量進行分析。目的蛋白的表達量=CDK4、Beclin-1及Bax與β-actin灰度值/內參的灰度值。

1.3觀察指標

1患者病灶組織CDK4、Beclin-1及Bax的相對表達量;2CDK4、Beclin-1及Bax在不同病理特征EC患者中的表達情況。

1.4統計學方法

采用SPSS19.0統計學軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，不符合正態分布的計量資料如CDK4、Beclin-1及Bax水平采用M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗，計數資料用[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組患者病灶組織CDK4、Beclin-1及Bax的相對表達量的比較

觀察組CDK4表達水平高于對照組，觀察組Bax及Beclin-1水平低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2CDK4、Beclin-1及Bax在不同病理特征EC患者中的表達情況

低、未分化程度、FIGO分期III～IV期、有淋巴結轉移、肌層浸潤≥1/2患者的CDK4表達水平高于中、高分化程度、FIGO分期I～II期、無淋巴結轉移、肌層浸潤<1/2的患者;低、未分化程度、FIGO分期III～IV期、有淋巴結轉移、肌層浸潤≥1/2患者中Beclin-1及Bax表達水平低于中、高分化程度、FIGO分期I～II期、無淋巴結轉移、肌層浸潤<1/2的患者，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3討論

EC是常見女性生殖系統惡性腫瘤，其病死率較高，對女性生命健康構成嚴重威脅。目前仍尚未完全闡明EC的發病機制，由于EC的發生發展及轉歸涉及多種復雜因素，在探討預測EC患者預后指標方面一直以來都是研究熱點。相關研究[3-5]顯示，子宮內膜癌發病率呈逐年增加的趨勢，其主要治療方法為手術治療，結合化療、放療、免疫療法等可改善患者預后。相關研究[6]證實，子宮內膜由于血運豐富，可為腫瘤細胞的生長提供大量營養物質。相關研究[7]顯示，子宮內膜癌患者癌細胞增殖狀態對疾病發展產生重要作用，而病灶部位新生血管是細胞增殖狀態的基礎且受多種因子的調控，其中CDK4是調控子宮內膜癌患者病灶部位新生血管的主要基因之一。

相關研究[8]顯示，CDK4能夠結合cyclinD1進而形成促進癌細胞周期改變的復合物，同時體外研究[9]顯示，這種復合物對于子宮內膜癌細胞增殖具有誘導作用。機體也能夠對癌細胞增殖產生調控作用，主要通過誘導細胞凋亡進而減少受損及衰老細胞，抑制增生性疾病的發生，國外研究[10]顯示，在調控細胞凋亡的蛋白中，Beclin-1蛋白家族是參與細胞增殖及凋亡平衡的主要調控蛋白，大量的Beclin-1能夠發揮抑制細胞凋亡的作用，同時保護細胞存活并抑制其惡性增殖及異常積累。研究[11]表明，在子宮內膜癌患者病灶組織Beclin-1表達量呈低水平。Bax是Beclin-1家族蛋白中的促凋亡基因，研究[12]顯示，Bax在機體組織器官中廣泛表達，在細胞發生凋亡且受到死亡信號的刺激后，Bax可從細胞質中轉移至線粒體，與線粒體膜結合形成同源二聚體并促進細胞凋亡。此外有研究[13]指出，Bax與線粒體膜結合后能夠促進線粒體中細胞色素C進入細胞質，誘導并激活Caspase家族介導的凋亡級聯反應，對細胞凋亡產生加速作用。研究[14]表明，自噬作用在多個層面影響腫瘤發展，而Beclin-1是關于機體自噬的抑癌基因，其表達水平升高能夠促進癌細胞自噬，主要通過Beclin-1對細胞自噬體成熟的調控作用實現[15]，此外Beclin-1能夠與III型磷脂酰基肌醇3激酶結合形成復合物進而調控細胞自噬過程。有研究[9]采用雌激素樣受體拮抗劑干預人子宮內膜癌細胞，結果顯示，雌激素樣受體拮抗劑可通過上調CDK4蛋白表達發揮較弱的促增殖作用。高金利等[16]研究顯示，microRNA-203-5p能夠通過靶向下調子宮內膜癌小鼠的H編碼人表皮生長因子受體4的癌基因，上調Bax的表達水平，進而發揮誘導子宮內膜癌凋亡的作用。在本研究中，觀察組的CDK4表達水平高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），Beclin-1及Bax的表達水平低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），提示在EC患者中存在細胞的增殖速度加快及凋亡速度減慢，與目前文獻報道一致[17-19]。分析后認為，細胞自噬及凋亡功能的損害可導致機體無法及時清除正常細胞，進而導致腫瘤細胞的增殖，故在本研究中可觀察到EC患者Bax及Beclin-1水平的降低。本研究中對不同病理特征EC患者的CDK4、Beclin-1及Bax表達情況進行分析，結果顯示，CDK4在中、高分化、FIGO分期III～IV期、有淋巴結轉移、肌層浸潤≥1/2患者中表達水平較高，Beclin-1及Bax在中、高分化、FIGO分期III～IV期、有淋巴結轉移、肌層浸潤≥1/2患者中表達水平較低，差異有統計學意義（P<0.05）。提示Beclin-1及Bax低表達、CDK4高表達的EC患者病灶組織惡性程度更高、侵襲性更強、預后更差。分析后認為，腫瘤臨床分期、病理分型及是否合并淋巴轉移是評估腫瘤生長情況的重要指標，對于FIGO分期更高、合并淋巴結轉移的患者而言，其腫瘤數量更多，疾病嚴重程度更重，可能是由于Beclin-1及Bax表達下調導致腫瘤細胞過度增殖所致。

綜上所述，EC患者病灶組織的Beclin-1、Bax及CDK4與子宮肌瘤患者存在明顯差異，Beclin-1、Bax及CDK4可作為評估EC患者預后的指標。

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（收稿日期：2021-09-30）