miR-370對肺癌細胞增殖、遷移活力的調節作用及分子機制研究

韓春全 黃 瓊

(漳州市第三醫院腫瘤內科 漳州 363000)

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤，發病率、死亡率均呈明顯上升趨勢[1-2]，雖然手術切除、放化療、靶向藥物等綜合治療的開展使患者的生存時間得以延長，但多數患者會因為基因突變而出現耐藥性、進而影響療效及預后。因此，尋找新的治療靶點是肺癌相關研究的關注熱點。微小RNA(microRNAs，miRs)是一類在轉錄后水平調節基因表達的小分子RNA，在多種惡性腫瘤的發生發展中起到不同作用。劉馨[3]的研究報道，肺癌組織中miR-370的表達顯著下調，EGFR的表達顯著上調且miR-370與EGFR的表達具有負相關關系，進一步的雙熒光素酶實驗證實miR-370能夠與EGFR基因3’UTR結合，表明miR-370能夠靶向抑制EGFR的表達。EGFR是一種酪氨酸激酶受體，在肺癌的發生發展過程中能夠刺激癌細胞的增殖、遷移[4-7]，但miR-370是否通過靶向EGFR抑制肺癌細胞的增殖、遷移尚未明確。為此，本實驗將以肺癌A549細胞株為對象，具體分析miR-370靶向EGFR調控癌細胞增殖、遷移的作用及機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞

肺癌A549細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.2試劑

miR-370 mimic、陰性對照(NC)mimic購自上海吉瑪制藥技術有限公司，EGFR質粒、空白質粒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，miRNA提取分離試劑盒、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量檢測試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，細胞增殖活力MTS法檢測試劑盒購自Promega公司，EGFR的單克隆抗體購自Abcam公司。

1.1.3儀器

熒光定量PCR儀購自Bio-rad公司，酶標儀購自Bio-tek公司，顯微鏡購自Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養及分組

A549細胞在含有10%胎牛血清的DMEM中貼壁培養，常規消化傳代后接種在培養板中并分組干預，方法如下：對照組用不含mimic、質粒的DMEM處理，NC mimic組轉染NC mimic、miR-370 mimic組轉染miR-370 mimic，空白質粒組轉染空白質粒，空白質粒+miR-370 mimic組同時轉染空白質粒和miR-370 mimic，EGFR質粒+miR-370 mimic組同時轉染EGFR質粒和miR-370 mimic。

1.2.2miR-370表達的檢測

傳代后的A549細胞接種在12孔培養板中，按照方法1.2.1部分分組干預48h，棄去培養基、保留細胞，采用miRNA提取分離試劑盒分離細胞中的miRNA，采用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將miRNA反轉錄為cDNA，采用miRNA熒光定量檢測試劑盒配置PCR反應體系并進行PCR擴增，分別擴增miR-370及U6，根據擴增曲線計算miR-370的表達水平。

1.2.3細胞增殖活力的檢測

傳代后的A549細胞接種在96孔培養板中，按照方法1.2.1項下分組干預48h，采用MTS法檢測細胞增殖活力，按照試劑盒說明書進行操作，在酶標儀上檢測490nm波長的吸光值、記為OD490。

1.2.4細胞遷移活力的檢測

傳代后的A549細胞接種在12孔培養板中，用黃槍頭在細胞板底部中央做一劃痕，在顯微鏡下觀察劃痕、拍照記錄并計算劃痕面積A0；按照方法1.2.1部分分組干預48h，在顯微鏡下觀察劃痕、拍照記錄并計算劃痕面積A24，按照(A0-A24)/A0計算相對愈合面積。

1.2.5EGFR表達的檢測

傳代后的A549細胞接種在12孔培養板中，按照方法1.2.1項下分組干預48h，棄去培養基、保留細胞，采用RIPA裂解液提取細胞中的蛋白并測定蛋白含量，取30μg蛋白進行western blot檢測，先進行電泳，而后電轉移至NC膜，5%脫脂牛奶室溫封閉NC膜1h，1∶1000稀釋的EGFR單克隆抗體4℃孵育NC膜過夜；次日，1∶1000稀釋的HRP二抗室溫孵育NC膜1h，最后顯影得到蛋白條帶，根據條帶的灰度值計算表達水平。

1.3 統計學處理

采用SPSS21.0統計學軟件進行數據處理，3組間計量資料的比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-370 mimic對A549細胞中miR-370表達的影響

轉染miR-370 mimic后，miR-370 mimic組A549細胞中miR-370的表達水平明顯高于對照組及NC mimic組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 3組A549細胞中miR-370表達的比較

2.2 miR-370 mimic對A549細胞增殖活力的影響

轉染miR-370 mimic后，miR-370 mimic組A549細胞的OD490水平明顯低于對照組及NC mimic組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 3組A549細胞OD490水平的比較

2.3 miR-370 mimic對A549細胞遷移活力的影響

轉染miR-370 mimic后，miR-370 mimic組A549細胞的相對愈合面積明顯低于對照組及NC mimic組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、表3。

圖1 3組A549細胞的劃痕圖像

2.4 miR-370 mimic對A549細胞EGFR表達的影響

轉染miR-370 mimic后，miR-370 mimic組A549細胞中EGFR的表達水平明顯低于對照組及NC mimic組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2、表4。

圖2 3組A549細胞EGFR的蛋白電泳圖

表4 3組A549細胞中EGFR表達水平的比較

2.5 過表達EGFR對miR-370 mimic調節A549細胞增殖、遷移的影響

與空白質粒組比較，空白質粒+miR-370 mimic組A549細胞的OD490水平、相對愈合面積明顯降低(P<0.05)；與空白質粒+miR-370 mimic組比較，EGFR質粒+miR-370 mimic組A549細胞的OD490水平、相對愈合面積明顯增加(P<0.05)，見表5。

表5 3組A549細胞OD490水平、相對愈合面積的比較

3 討論

miRs是具有廣泛生物學功能的非編碼小分子RNA，能夠在轉錄后水平抑制靶基因的表達并產生相應的生物學效應。近年來，miRs在惡性腫瘤發生發展中的作用受到了越來越多關注，靶向原癌基因的miRs能夠發揮抑癌作用、靶向抑癌基因的miRs能夠發揮促癌作用，增加抑癌miRs表達或減少促癌miRs表達成為了治療惡性腫瘤的新靶點[8-10]。

miR-370是一種具有抑癌作用的miR，已有研究報道，miR-370對結腸癌細胞、肝癌細胞、胃癌細胞的增殖及遷移具有抑制作用[11-14]。國內劉馨[3]的研究報道，肺癌組織中miR-370的表達顯著下調，提示miR-370能夠在肺癌的發生發展中起到抑癌作用，但國內尚無miR-370直接調控肺癌細胞增殖、遷移的相關基礎研究。本實驗選擇肺癌A549細胞是實驗對象，經熒光定量PCR證實轉染miR-370 mimic能夠增加細胞中miR-370的表達后，進一步觀察了細胞的增殖活力和遷移活力。經MTS發生測定增殖活力可知：增加miR-370表達能夠抑制A549細胞的增殖；經劃痕實驗測定遷移活力可知：增加miR-370表達能夠抑制A549細胞的遷移。以上結果表明，miR-370對肺癌細胞的增殖和遷移具有抑制作用，與其在肺癌組織中低表達的趨勢吻合，說明miR-370在肺癌的發生發展中起抑癌作用。

國內劉馨的研究對miR-370的靶基因進行了初步探究，該研究通過雙熒光素酶報告基因的檢測證實miR-370靶向結合EGFR基因的3'UTR。EGFR在肺癌細胞的增殖、遷移中均起到促進作用，miR-370靶向EGFR的作用與其抑制肺癌細胞增殖、遷移的作用吻合。本實驗在劉馨的研究基礎上觀察了miR-370在肺癌細胞中調控EGFR表達的作用，在增加miR-370的表達后，A549細胞中EGFR的表達水平明顯降低，說明miR-370能夠抑制肺癌細胞中EGFR的表達，與既往研究報道miR-370靶向EGFR基因3'UTR的結果吻合。在此基礎上，本實驗還設計了表達EGFR的質粒，在轉染miR-370 mimic的同時也轉染了表達EGFR的質粒，在增加EGFR的表達后、miR-370抑制A549細胞增殖及遷移的作用發生了逆轉，由此證實miR-370通過靶向抑制EGFR表達的方式抑制肺癌細胞的增殖和遷移。

綜上所述，miR-370能夠降低肺癌細胞的增殖、遷移活力，抑制EGFR表達是miR-370發揮上述作用的分子機制之一。