EGCG 通過抑制TGF-β1/Smads 信號通路改善高脂高糖飲食誘導的肥胖大鼠心肌纖維化

劉 聰 ，吳貴帥 ，普 瑞 ，李樹德 ，陶建平 ，張忍發

（1）昆明醫科大學第二附屬醫院麻醉科，云南 昆明 650101；2）昆明醫科大學基礎醫學院；3）基礎醫學院生物化學與分子生物學系；4）體育部，云南 昆明 650500）

隨著遺傳、社會環境、飲食結構等外界因素的變化，肥胖導致的相關疾病日益增多。當人體攝入能量超過消耗能量時，白色脂肪儲存的甘油三酯增多，導致肥胖的出現[1]。在肥胖的狀態下，白色脂肪組織不僅用于儲存多余的脂肪，還發揮著重要的內分泌功能，如分泌脂肪因子和釋放炎癥細胞因子，而這些細胞因子可擾亂全身能量平衡，導致各種代謝紊亂[2]。肥胖也可引起機體缺氧、觸發炎癥反應、氧化應激、重要臟器血管生成減少以及纖維化[3]。心肌纖維化是心肌損傷后心肌中促纖維化因子表達增多，肌成纖維細胞分化和轉化增多，細胞外基質的表達增加，導致心室肌順應性下降，影響正常心臟的舒縮功能，是臨床引發心律失常、心功能障礙甚至心源性猝死的主要原因[4]。因此，尋找有效的藥物預防和改善心肌纖維化，成為當前急需解決的問題。

茶葉中含有大量的多元酚類化合物，這些化合物統稱為茶多酚，約占茶葉干重的25%～35%[5]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是茶多酚中含量最高，研究最廣的主要活性成分[6]。大量的研究表明，EGCG 具有廣泛的生物活性特征，包括抗氧化、抗腫瘤、保護心腦血管、抗炎癥、抗糖尿病等[7-8]。但在肥胖模型中，EGCG 是否通過抑制氧化應激，減輕心肌纖維化及機制未見系統報道。本研究在建立肥胖大鼠心肌纖維化模型的基礎上給予EGCG 治療，觀察其對肥胖大鼠心肌損傷的保護作用，進一步探討其對心肌TGF-β1/Smads信號通路表達的影響，為尋找防治心肌纖維化的藥物提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF 級SD 雄性大鼠，體重200～220 g，購自昆明醫科大學實驗動物部，通過實驗動物福利倫理審查。大鼠可自由攝取食物和水，飼養條件：恒溫（22±2）℃，恒濕（55±5）%，光照明暗各12 h。普通飼料適應性喂養2 周后，按照隨機數字表法將大鼠分成2 組，分別為普通飼料組（正常組，11 只）喂養32 周，高脂高糖（飼料成分：47%普通飼料、39% 蔗糖、15% 豬油、5% 雞蛋蛋黃、2%膽固醇、和1%膽酸鈉）組（41 只）喂養32 周，確定肥胖模型建立成功后。將高脂高糖組按照隨機數字表法分為模型組（11 只）、EGCG 低劑量組（10 mg/kg/d，10 只）、EGCG 中劑量組（40 mg/kg/d，10 只）和EGCG 高劑量組（160 mg/k/d，10 只）。其中，給予低/中/高劑量的EGCG 每天1次灌胃治療4 周，正常組和模型組不做處理。麻醉狀態下，收集血液和心肌組織。一部分心肌組織固定于多聚甲醛中，剩余部分于-80 ℃冰箱保存。

1.2 血液指標檢測

收集血液離心分離后獲得血清，采用血清檢測空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）（ELISA 法）、甘油三酯（triglyceride，TG）（乙酰丙酮微板法）、總膽固醇（total cholesterol，TC）（COD-PAP 單試劑微板法）、丙二醛（methane dicarboxylic aldehyde，MDA）（TBA 微板法）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）（DTNB 速率微板法）含量。

1.3 Masson 染色觀察心肌組織

部分心肌于多聚甲醛中至少固定48 h，然后進行脫水、透明，浸蠟后對心肌組織進行石蠟包埋。包埋好的心肌組織連續切片后，按北京索萊寶公司Masson 三色染色試劑盒說明書操作，顯微鏡下觀察，Image Tools 進行纖維化定量分析心肌膠原容積分數（collagen volume fraction，CVF）。

1.4 Western blotting 檢測

用電子天平稱量心肌放入含有混合蛋白酶抑制劑的高效RIPA 裂解液中，勻漿、離心，收集上清液，使用BCA 蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，然后進行SDS-PAGE 電泳、用PVDF 膜轉膜后，加入一抗TGF-β1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Smad7、Smad2/3、p-Smad2/3（一抗稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST 溶液漂洗；加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶10 000），常溫孵育2 h 后，TBST 溶液漂洗后使用ECL 發光試劑盒和凝膠成像系統對蛋白進行顯影，結果使用Image Tools 進行灰度值分析。

1.5 統計學處理

使用軟件SPSS21.0 進行統計學分析。造模成功肥胖大鼠體重用（）表示，2 組資料間使用獨立樣本t檢驗進行比較，2 組以上的多組資料之間比較則采用單因素方差分析。應用 GraphPad Prism6.0 版進行圖片制作，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠體重

EGCG 給藥前，與正常組相比，模型組大鼠體重增加（P＜0.05）；以普通飼料喂養的大鼠體重平均值為基數，當高脂高糖飼料喂養的大鼠體重超過該值的 20% [即比率（%）=（）/×100%。本實驗該值為20.28%）]，提示肥胖的動物模型建立成功[9]，見表1、圖1A。EGCG 給藥后，與模型組大鼠比較，EGCG 低、高劑量組體重降低（P＜0.05），EGCG 中劑量組體重降低不明顯（P＞0.05），EGCG 各治療組劑量依賴性不明顯。提示EGCG 對肥胖大鼠體重具有降低作用，見圖1B。

圖1 大鼠體重Fig.1 Body wight in the rats

表1 EGCG 給藥前大鼠體重（）Tab.1 Body wight in the rats before EGCG treatment

表1 EGCG 給藥前大鼠體重（）Tab.1 Body wight in the rats before EGCG treatment

2.2 大鼠血糖、血脂含量

與正常組比較，模型組大鼠FBG 升高（P＜0.05），與模型組相比，EGCG 低劑量組FBG降低不明顯（P＞0.05），EGCG 中、高劑量組FBG降低（P＜0.05），見圖2A。與正常組比較，模型組大鼠TG 升 高（P＜0.05），與模型 組相比，EGCG 低劑量組TG 水平降低不明顯（P＜0.05），EGCG 中、高劑量組TG 水平降低（P＜0.05），見圖2B。與正常組比較，模型組大鼠TC 升高（P＜0.05），與模型組相比，EGCG 各劑量組TG 水平降低（P＜0.05），見圖2C。EGCG 各治療組具有劑量依賴性。提示EGCG 能夠降低肥胖大鼠血糖，改善脂質代謝紊亂。

圖2 各組大鼠空腹血糖、甘油三酯、總膽固醇的水平變化Fig.2 FBG、TG、TC levels in the rats in each group

2.3 EGCG 對肥胖大鼠血清氧化應激相關因子的檢測

與正常組比較，模型組大鼠MDA 水平升高（P＜0.05），與模型組相比，EGCG 低、中劑量組MDA 水平降低（P＜0.05），EGCG 高劑量降低不明顯（P＞0.05），見圖3A。與正常組比較，模型組大鼠GSH 水平降低（P＜0.05），與模型組相比，EGCG 中劑量組水平升高（P＜0.05），EGCG 低、高劑量組GSH 升高不明顯（P＞0.05），見圖3B。EGCG 各治療組劑量依賴性不明顯。提示EGCG可抑制肥胖大鼠的氧化應激。

圖3 各組大鼠丙二醛、谷胱甘肽的水平變化Fig.3 MDA、GSH levels in the rats in each group

2.4 心臟組織Masson 染色

與正常組相比，模型組大鼠心肌間質發現大量藍色的膠原纖維，CVF 升高（P＜0.05）；與模型組比較，EGCG 各劑量組心肌纖維化程度逐漸減輕，其中EGCG 中、高劑量組CVF 降低（P＜0.05），見圖4A-F。提示EGCG 能降低肥胖大鼠心肌纖維化的程度。

圖4 心肌組織Masson 染色（400×）Fig.4 Masson staining of heart tissue（400×）

2.5 Western blotting 檢 測 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達

與正常組比較，模型組中的Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ條帶的灰度值增加，Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達量升高（P＜0.05），與模型組比較，EGCG 各劑量組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ條帶的灰度值逐漸變淺，EGCG 低劑量組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達量減少不明顯（P＞0.05），EGCG 中、高劑量組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達量減少（P＜0.05），見圖5A～C。EGCG 各治療組具有劑量依賴性。提示EGCG能降低肥胖大鼠心肌纖維化心臟組織中CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白表達。

圖5 大鼠心臟組織中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的蛋白表達Fig.5 Protein expression of Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ in rat heart tissue

2.6 Western blotting 檢測TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad7 蛋白表達

與正常組比較，模型組中的TGF-β1 條帶的灰度值增加，TGF-β1 蛋白表達量升高（P＜0.05），與模型組比較，EGCG 各劑量組TGF-β1 條帶的灰度值逐漸變淺，TGF-β1 蛋白表達量減少（P＜0.05），見圖6A、B。與正常組比較，模型組中的Smad7 條帶的灰度值變淺，Smad7 蛋白表達量降低（P＜0.05），與模型組比較，EGCG 各劑量組Smad7 條帶的灰度值增加，Smad7 蛋白表達量升高（P＜0.05），見圖6A、C。與正常組比較，模型組中的Smad2/3 條帶的灰度值增加，Smad2/3 蛋白表達量升高（P＜0.05），與模型組比較，EGCG各劑量組Smad2/3 條帶的灰度值變淺，Smad2/3表達量降低（P＜0.05），見圖6A、D。與正常組比較，模型組中的p-Smad2/3 條帶的灰度值增加，p-Smad2/3 蛋白表達量升高（P＜0.05），與模型組比較，EGCG 各劑量組Smad2/3 條帶的灰度值變淺，EGCG 低劑量組和EGCG 中劑量組p-Smad2/3 蛋白表 達量降 低不明 顯（P＞0.05），EGCG 高劑量組p-Smad2/3 蛋白表達量降低（P＜0.05），見圖6A、E。EGCG 各治療組劑量依賴性不明顯。提示EGCG 能降低TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3 蛋白表達，同時增加Smad7 的蛋白表達，負性調控Smad2/3 的磷酸化。

圖6 大鼠心臟組織中TGF-β1、Smad7、Smad2/3、p-Smad2/3 的蛋白表達Fig.6 Protein expression of TGF-β1、Smad7、Smad2/3、p-Smad2/3 in rat heart tissue

3 討論

肥胖已經成為全球重要的社會問題之一，由其誘發的相關疾病嚴重危害人類的健康。目前研究認為，肥胖與糖尿病、心腦血管病和癌癥等疾病發生和發展密切相關[10-11]。研究表明高脂高糖誘導肥胖大鼠會出現嚴重的心肌損傷[3]。肥胖大鼠脂質代謝紊亂導致TG 和TC 異常升高、血液游離脂肪酸增多、活性氧類（reactive oxygen species，ROS）生成增加。ROS 引起體內氧化應激加劇，進一步誘導細胞死亡和組織器官的纖維化。筆者前期的研究發現，高脂高糖飲食32 周后，可出現心肌的纖維化。因此，本研究在大鼠32 周的高脂高糖飲食飼養的基礎上，檢測結果顯示大鼠體重、血清TG 和TC 增加，抗氧化物GSH 減少，氧化產物MDA 增加，心肌組織出現纖維化的表現。結果表明，在長期高脂高糖的誘導的肥胖模型中，出現氧化應激及心肌纖維化。

在心肌纖維化發生的研究機制中已經證實，TGF-β1 可通過激活經典（Smads）和非經典（非Smads）信號通路誘導纖維化，導致肌成纖維細胞的激活、細胞外基質的過度沉積而降解減少[12]。心肌纖維化受TGF-β1/Smads 通路的調節，其中存在于細胞質內Smad2/3 是調節的關鍵因子[13]。TGF-β1 可通過其下游的信號分子Smad2/3 進行信號轉導，在TGF-β1 的刺激下Smad2/3 磷酸化為p-Smad2/3，磷酸化的信號分子具有生物學活性，能夠增加膠原蛋白合成和沉積，增強成纖維細胞活力，進而出現纖維化[14-15]。Smad7 通過競爭TGF-β1 受體結合并誘導其降解來抑制Smad2/3 磷酸化，從而在抗TGF-β1 纖維化反應中發揮關鍵作用[16]。本研究的結果表明，在長期高脂高糖飲食誘導的肥胖模型中，心肌組織細胞中的TGF-β1/Smads 通路的關鍵因子TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3 蛋白的表達上調，Smad7 蛋白的表達下調，細胞外基質的主要成分Collagen I、Collagen Ⅲ蛋白的含量增多。這些結果表明，肥胖可能通過氧化應激加劇，激活心肌組織的TGFβ1/Smads 通路，導致心肌組織膠原生成增多，引起心肌的纖維化。

目前心肌纖維化的預防和改善是臨床較難解決的問題。有研究已經表明[17]，注射人臍帶間充質干細胞可以減輕大鼠擴張型心肌病模型的心肌纖維化和功能障礙，可能是通過抑制TGF-β1 纖維化途徑。人參皂苷Rg2[18]、芪藶強心[19]、明醛脫氫酶2 酶活性[20]的激活可抑制TGF-β1/Smads信號通路及相關分子的表達，抑制心肌纖維化。EGCG 是2-苯基苯的衍生物，由三個必需環（A、B 和C）和一個含有沒食子酰基組成的D 環，許多酚羥基分布在它的A、B、D 環上，重要的是B、D 環上存在三個鄰位酚羥基，使具有較強的抗氧化能力和清除自由基能力[21]，可上調多個轉錄途徑以改善高脂飲食誘發的氧化應激和胰島素抵抗，還通過抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B 增加葡萄糖攝取的表達，來影響機體對糖、脂的吸收[22]；EGCG 可降低脂肪酸合成酶的表達，從而減少脂肪酸生成[23]；此外，EGCG 可減少ROS 的生成，EGCG 可以清除氧自由基并調節脂肪酸攝入和脂質代謝，抑制細胞凋亡[24]，還可以增加脂肪氧化和脂解[25]。這些結果表明EGCG 具有潛在地改善肥胖及其并發癥的作用[26]。本研究采用EGCG 灌胃治療高脂高糖飲食32 周后的肥胖大鼠模型，結果表明：EGCG 可降低肥胖大鼠體重、血液脂質（TG、TC）、氧化產物（MDA），增加抗氧化物（GSH）；EGCG 可降低 心肌組 織Collagen I、Collagen Ⅲ蛋白的含量。結果也發現：EGCG 誘導TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3 蛋白的表達下調，Smad7 蛋白的表達上調。這些結果提示，EGCG可能抑制氧化應激誘所導的TGF-β1/Smads 通路，改善心肌纖維化。

綜上所述，EGCG 具有降低血糖，改善脂質代謝，抑制氧化應激介導的TGF-β1/Smads 通路，減少細胞外基質的沉積，改善心肌纖維化。本研究將為EGCG 預防和改善肥胖導致的心肌纖維化提供新的思路。