腦特異性miRNA-9介導IGF-1R信號對腦缺血再灌注神經損傷大鼠的保護及作用機制

鄧婭，王順先

(1.達州中醫藥職業學院基礎醫學部，四川 達州 635000；2.川北醫學院附屬醫院神經內科，四川 南充 637000)

腦血管疾病具有發病率高、死亡率高特點，其中缺血性腦疾病發病率占腦血管疾病80%以上[1]。腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia/ reperfusion injury，CI/RI)指突然中斷腦組織供血且在恢復腦供血時錯過了最佳的時間，導致腦功能不僅沒得到改善，反而加重大腦功能障礙和結構損傷[2]。腦缺血可改變腦血管內皮細胞的狀態，由正常時的靜止到缺血時的促炎，進而加速了血腦屏障的破壞。此外，腦缺血還會誘發多種基因突變，其中微小核糖核酸(miRNA)可能介導CI/RI的發生發展[3]。miRNA可通過調控基因的表達介導多種疾病的發生發展。miRNA-9是一類主要在神經系統中表達的小分子RNA，其在神經組織分化、腦成熟中發揮重要作用[4]，可介導多種生物學功能，包括影響腦發育，調節神經干細胞的增殖、分化和凋亡等[5]。但目前miR-9對CI/RI的作用機制報道極少。腦缺血性損傷后機體組織處于復雜的、多基因作用的神經保護網絡中，其中胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)在該網絡中起重要作用[6]，可通過維持細胞生長和抑制細胞凋亡來促進受損神經細胞的恢復[7]。本研究擬探討miR-9治療CI/RI模型大鼠的療效，并觀察其能否通過調控IGF-1對CI/RI大鼠進行保護。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

40只SD大鼠均購自川北醫學院醫學院動物實驗中心，許可證號：SCSK(川)2018-18。大鼠均為6周齡，體重200～220 g，雌性、雄性大鼠均為20只。所有大鼠均飼養在統一的動物房內，室溫恒定22～24 ℃，相對濕度50～55%，光照12 h/ 12 h晝夜交替。本次動物實驗符合動物倫理委員會批準(2022-0028)。

1.2 試劑和儀器

miR-9 inhibitor質粒、miR-NC質粒(生工生物工程技術服務有限公司)；IGF-1抗體、 IGF-1R抗體(南京建成生物工程研究所)；β-actin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG(武漢三鷹生物技術有限公司)；放射免疫沉淀法裂解緩沖液(RIPA裂解液)、二辛可寧酸(BCA)蛋白試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)和化學發光試劑盒(上海碧云天生物技術公司)；L3000015LipofectamineTM2000轉染試劑(上海恒斐生物科技有限公司)；MA-688PCR儀(中國伯樂有限公司)；CH-6010型機械勻漿機(瑞士kinemaica公司)腦立體定位儀(型號 51700，美國Stoelting公司)、全自動發光儀(型號AC-CESS2，美國貝克曼庫爾特公司)。

1.3 分組和模型制備

將大鼠分為sham組、CI/RI組、miR-NC組和miR-9 inhibitor組，每組各10只。本實驗根據MCAO法[6]制備CI/RI大鼠模型。麻醉各組大鼠并固定，沿大鼠頸部中線剪2 cm的切口，將大鼠頸部皮膚逐層分離，暴露頸總、頸外和頸內動脈并游離，暫時將頸總和頸外動脈夾閉，并于頸外動脈處用剪刀剪一個小口，去掉動脈夾，插入線栓，感覺到有稍微的阻力時停止插入。2 h后把插入的線栓拔出形成再灌注，用絲線扎緊動脈的殘端，逐層縫合頸部皮膚。Sham組大鼠和其它各組大鼠的操作步驟相同，但不進行結扎。造模成功標準：大鼠出現神經功能缺損。本研究制備的所有CI/RI模型大鼠均造模成功。

再灌注5 min時，miR-NC組大鼠經左側腦室注射2 μL濃度為100 μmol/L miR-NC質粒干預，miR-9 inhibitor組大鼠經左側腦室注射2 μL濃度為100 μmol/L miR-9 inhibitor質粒干預，sham組和CI/RI在大鼠注射100 μmol/L生理鹽水干預。24 h后行后續實驗。

1.4 神經行為學評分

參照既往研究[8]中方法檢測神經功能，1～3分為成功制備CI/RI模型。見表1。

表1 神經功能評分標準

1.5 檢測方法

1.5.1 RT-PCR檢測各組海馬組織中miR-9表達水平 每組取部分大鼠，頸椎脫臼處死后剪下頭顱，沿枕骨大孔剪開顱骨，取出完整的腦組織，生理鹽水清洗腦組織上血跡。切除小腦，分開左右腦半球，將左腦下方的腦橋剝離開，可見一月牙狀結構即為海馬組織，將海馬組織剝離，置于凍存管中液氮凍存。各組取50 mg海馬組織，將1 mL裂解液加入到海馬組織中，用均漿器冰上研磨，置于EP管中靜置，使核酸與蛋白質完全解離。加入200 μL氯仿，振蕩為乳狀后靜置4 min，13 000 rpm離心10 min，收集上層含RNA的無色水相層約500 μL，純化并鑒定RNA的完整性。取純度和完整性較好的RNA，65 ℃熱變形5 min，去除RNA形成的高級結構以提高轉錄效率，置于冰上預冷。配置逆轉錄體系，振蕩均勻后瞬時離心后進行逆轉錄反應。將獲得的cDNA稀釋50倍，根據逆轉錄試劑盒說明書配制20 μL熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)反應體系：95 ℃下變性30 s，循環條件為95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，共40個循環，最后72 ℃延伸2 min。2-△△Ct法計算miR-9的相對表達水平。引物序列見表2。

表2 引物序列

1.5.2 TTC染色檢測各組腦梗死面積 取各組部分大鼠腦組織，于-20 ℃環境冷凍30 min。取出冷凍后的腦組織切成厚度為2 mm的組織切片，用2%TCC染色液染色腦組織切片，避光孵育組織切片30 min，每隔5 min對切片進行翻動，避免染色不均。用多聚甲醛溶液固定組織切片，分析各組大鼠腦梗死面積。

1.5.3 HE染色檢測各組腦組織病理學變化 給藥24 h后，取各組部分大鼠麻醉并處死，取出腦組織置于多聚甲醛溶液中，固定24 h后置于石蠟中，包埋組織后切片，厚度為4 μm，將蘇木素染色液加入到組織切片中，3 min取出用伊紅染色，將中性樹脂加入到組織切片中封片，最后用顯微鏡觀察變化。

1.5.4 TUNEL染色檢測各組神經元凋亡情況 按照1.5.3中方法制備腦組織切片，將組織切片進行脫蠟處理，后將酒精加入到組織切片中浸泡，取出組織置于TUNEL染色劑中。中性樹脂封片，纖維鏡下觀察組織切片中細胞凋亡情況。

1.5.5 蛋白印跡法檢測腦組織中IGF-1、IFG-1R蛋白表達 給藥24 h后，取各組部分大鼠麻醉并處死，取腦組織50 mg，加入300 μL含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中，均漿器冰上研磨組織10 min，于4 ℃下16 000 rpm離心10 min，收集120 μL上清液于EP管中，加入4×上樣緩沖液40 μL，沸水中煮沸5～10 min使蛋白質變性，冰上冷卻2 min存于-20 ℃冰箱保存，用于蛋白電泳上樣，離心管中剩余上清液用BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白質，加入上樣緩沖液，95 ℃煮沸5 min，進行SDS-PAGE電泳。電泳后，將分離的蛋白條帶轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。蛋白樣品中分別加入IGF-1(1∶500)、IGF-1R(1∶500)、β-actin(1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過夜。三乙醇胺緩沖鹽溶液-吐溫20(TBST)洗膜后，加入HRP標記的二抗IgG(1∶2 000)。37 ℃孵育2 h。TBST洗膜，加入增強型化學發光(ECL)液避光顯影。Image J圖像軟件分析各蛋白條帶的灰度值。以β-actin為內參，目標蛋白與β-actin條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達水平。

1.5.6 雙熒光素酶報告靶基因熒光檢測 采用TargetScan7.1在線靶基因預測軟件驗證了IGF-1R是miR-9的假定靶點。IGF-1R的野生型(wide type，wt)3′-URT包含預測的miR-9結合位點和突變型(mutant，mut)IGF-1R 3′-URT被上海基因有限公司化學擴增，并插入pMIR報告熒光素酶報告質粒生成熒光素酶質粒，分別稱為pMIR-IGF-1R-3′-URTwt和pMIR-IGF-1R-3′-URTmut。轉染前1 d將HEK-293T細胞接種到24孔板中，使用與pMIR-IGF-1R-3′-URTwt、pMIR-IGF-1R-3′-URTmut和miR-NC或miR-9質粒共轉染。轉染48 h后檢測其熒光素酶活性。見表3。

表3 共轉染分組

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠神經行為學評分比較

sham組大鼠神經功能評分為0。CI/RI組(2.85±0.12)高于sham組(P<0.05)；miR-9 inhibitor組(1.15±0.08)低于CI/RI組(P<0.05)；CI/RI組與miR-NC組(2.86±0.13)比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.2 各組大鼠海馬組織中miR-9表達水平比較

CI/RI組大鼠海馬組織中miR-9相對表達量(2.13±0.14)高于sham組(1.00±0.09)(P<0.05)；miR-9 inhibitor組大鼠海馬組織中miR-9相對表達量(0.78±0.07)低于CI/RI組(P<0.05)；CI/RI組大鼠海馬組織中miR-9相對表達量和miR-NC組(2.12±0.14)比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.3 各組大鼠腦梗死面積比較

CI/RI組大鼠腦梗死面積(28.13±1.26)多于sham組(P<0.05)；miR-9 inhibitor組大鼠腦梗死面積(9.24±1.05)小于CI/RI組P<0.05)；且CI/RI組大鼠腦梗死面積與miR-NC組(28.56±1.27)比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

2.4 各組大鼠腦組織病理學變化比較

和sham組相比，CI/RI組神經元大量壞死，細胞核固縮并出現大量溶解，神經元排列無規則且稀疏；海馬帶寬度不規則，CA1區椎體的數量也較sham組減少，且排列無規律；和模型組相比，miR-9 inhibitor組神經元損傷得到明顯改善，細胞形態基本趨于正常，海馬帶整齊排列，且CA1區椎體細胞排列緊密、整齊，細胞極性變好；miR-NC組和CI/RI組大鼠腦組織病理學比較無明顯差異。見圖4。

2.5 各組大鼠神經元凋亡比較

和sham組相比，CI/RI組大鼠神經元凋亡數量(37.45±2.37%)增加(P<0.05)；和CI/RI組相比，miR-9 inhibitor組大鼠神經元凋亡數量(8.42±1.17%)減少(P<0.05)；且CI/RI組大鼠神經元數量和miR-NC組(38.01±2.40%)比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5。

2.6 各組大鼠腦組織中IGF-1、IFG-1R蛋白表達水平比較

和sham組相比，CI/RI組大鼠腦組織中IGF-1、IFG-1R蛋白表達升高(P<0.05)；miR-9 inhibitor組大鼠腦組織中IGF-1、IFG-1R蛋白表達高于CI/RI組(P<0.05)；CI/RI組大鼠腦組織中IGF-1、IFG-1R蛋白表達和miR-NC組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖6。

2.7 miR-9靶向關系預測和鑒定

軟件顯示IGF-1R的3′UTR端與miR-9有堿基互補結合點位。在細胞中轉染野生型IGF-1R(IGF-1R-WT)時，miR-9組的熒光素酶活性高于miR-NC組(P<0.05)，但兩組的突變型IGF-1R(IGF-1R-MUT)比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖7。

3 討論

腦缺血會因多種因素導致神經元損傷，其發病機制與時間、空間級聯反應密切相關。腦缺血/再灌注損傷由多種病理過程所導致，例如氧化應激、細胞凋亡等多種病理生理過程，彼此間相互作用導致神經功能障礙[8-9]。大量研究[9-10]證明，miRNA可介導腦缺血子再灌注損傷的發生發展。部分研究[11]發現，miR-9在腦內高表達，能通過促進神經干細胞的生物學活性而影響大腦和神經元。本研究結果顯示，在腦缺血再灌注損傷大鼠模型中miR-9呈高表達，提示miR-9參與了大鼠CI/RI的過程，和既往研究[11]結果基本一致。

腦缺血/再灌注損傷時腦損傷程度可根據神經功能評分來進行判定，當評分升高，說明腦損傷程度越重[12]。本研究中，通過對CI/RI大鼠側腦室注射miR-9 inhibitor質粒發現，CI/RI大鼠腦組織中miR-9表達顯著降低，且大鼠的神經功能評分明顯降低，提示miR-9可改善CI/RI大鼠神經功能損傷。本研究繼續抑制CI/RI大鼠miR-9表達可減少CI/RI大鼠腦梗死面積，改善神經元狀態，減少神經元凋亡，提示抑制腦特異性miR-9能通過減少大鼠腦梗死面積和神經元凋亡保護缺血再灌注大鼠腦組織，能維持神經細胞的發育和分化。Tan等[13]研究發現，miR-9能對腦的發育進行有效調節。張玉敏等[14]研究證實，高表達miR-9可促進缺血性腦卒中患者血清中的炎癥因子含量增加。

多肽生長因子IGF-1可對腦損傷中的神經營養產生保護作用，其可通過結合IFG-1R來發揮多種生物學功能，包括促進神經功能恢復、抑制神經元細胞凋亡等[15]。IGF-1與IGF-1R在正常腦組織有少量表達，而腦缺血損傷發生后，腦組織中IGF-1與IGF-1R表達水平明顯增加[16]。本研究顯示，CI/RI組大鼠腦組織中IGF-1和IGF-1R蛋白表達均明顯增加，提示缺血再灌注損傷可促進腦組織中IGF-1與IGF-1R表達，通過miR-9 inhibitor干預后CI/RI大鼠腦組織中IGF-1與IGF-1R表達明顯高于CI/RI模型組，提示抑制miR-9能進一步促進內源性IGF-1與IGF-1R的合成與表達。IGF-1與IGF-1R表達上調，可調控下游信號通路，從而減輕缺血性腦損傷病情的發展，發揮神經保護作用[17]。王杰華等[18]研究證實，在腦缺血再灌注損傷中可通過促進IGF-1與IGF-1R表達改善腦損傷。為了探究miR-9對CI/RI大鼠的腦保護機制，本研究還驗證了IGF-1R和miR-9的靶向關系，miR-9可靶向抑制IGF-1R表達，提示抑制miR-9可靶向上調IGF-1R表達而發揮對CI/RI大鼠的腦保護作用。

綜上所述，抑制miR-9可對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織產生保護作用，其作用機制與促進IGF-1R信號通路相關。