lncRNA-LOC100505851對肝細胞癌的診斷及預后判斷價值

韓曉婷，王子安，畢國斌

(蚌埠醫學院第二附屬醫院腫瘤內科，安徽 蚌埠 233000)

肝癌是世界范圍內最常見消化系統惡性腫瘤之一，死亡率較高，對于肝細胞癌(HCC)而言，屬多發肝癌類型[1-2]。研究[3-4]顯示，在多種類型的惡性腫瘤中，對于HCC引發的死亡而言，在全球居第四位，在我國境內，經對HCC的發病率展開調查，位居第五，經對死亡率展開調查，位居第二。現階段，臨床在對罹患HCC的患者進行治療時，以采取化療方法、放療方法、免疫靶向治療及手術切除等為主，但是由于HCC細胞早期臨床表現隱匿，遠處轉移早，復發率高，上述臨床治療手段均不能達到理想效果[5-6]。因此，尋找特異性高的生物標志物對HCC的臨床早發現、早治療、改善生存預后尤為重要。對于長鏈非編碼RNA(lncRNA)來講，屬一類轉錄本長度在200nt以上的RNA分子，在編碼蛋白中并不參與，但一般以RNA的形式自轉錄調控、表觀遺傳調控、及轉錄后調控等通過，發揮對基因表達水平的調控作用。近年來關于lncRNA的相關研究發展迅猛，Yu等[7]發現，lncRNA-MALAT1可通過拮抗miR-142-3p促進肝癌細胞增殖、遷移和侵襲；Zeng等[8]表明，lncRNA-CASC9高表達可改善肝癌預后，是HCC的潛在診斷和預后指標之一；同時有報道指出，對于lncRNA-LOC100505851，其在罹患乳腺癌患者癌組織中的表達，相較癌旁組織呈更低顯示[9]，但就lncRNA-LOC100505851表達來講，對臨床罹患HCC患者的進行診斷、預后評估及預測則未有報道，因此本研究選取接受肝臟切除手術的HCC患者80例作為研究對象。并對其在癌組織及癌旁組織分布的lncRNA-LOC100505851 物質水平進行檢測，就兩組在病理特征與預后方面的差異展開分析，旨在提供給肝癌患者診治工作的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2018年12月蚌埠醫學院第一附屬醫院及蚌埠醫學院第二附屬醫院收治的接受肝臟切除手術的80例HCC患者作為研究對象。其中，男性42例，女性38例；年齡(45.36±3.74)歲。納入標準：(1)依據原發性肝癌規范化病理診斷指南(2015年版)[10]確診患者為HCC；(2)臨床及隨訪資料完整。排除標準：(1)術前接受放療或化療；(2)術后由于除腫瘤復發或轉移以外的原因死亡。本研究通過醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 檢測方法

1.2.1 主要儀器及試劑 離心機(Multifuge X1/X1R Pro，賽默飛)、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)儀(LightCycler 480，羅氏診斷)、紫外分光光度計(U-3900/3900H，日立)。Trizol、逆轉錄試劑盒Prime Script TM RT Master MiX及熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex Taq TM購自TaKaRa公司， lncRNA-LOC100505851與內參β-actin引物均由南京金斯瑞公司合成。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測lncRNA-LOC100505851在癌組織和癌旁組織的表達量 參考“7點”基線取材法[10]，術中取患者癌組織及距腫瘤邊緣>2 cm的癌旁肝組織，等滲鹽水漂洗，液氮速凍并做好標記后存于-80 ℃冰箱備用。采用Trizol法提取患者癌組織及癌旁組織中的總RNA：取300 mg速凍的癌組織及癌旁組織分別研磨至粉末狀，加入1 mL Trizol試劑，待相分離后取水相上清液離心沉淀，洗滌干燥后再次溶解，分光光度計測定RNA的濃度。按逆轉錄試劑盒說明合成互補脫氧核糖核酸(cDNA)，在冰上配制反應液(5×Prime Script RT Master MiX 2 μL；總RNA 5 μL；RNase-free dd H2O 3 μL)，輕柔混勻后進行加入DNA擴增儀中，反應條件為：37 ℃ 15 min反轉錄，85 ℃ 5 s反轉錄酶失活后，4 ℃保存。lncRNA-LOC100505851與內參β-actin引物，β-actin：F：5′-CCC ATC TAT GAG GG TTAC GC-3′，R：5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′，擴增片段長度為379 bp；lncRNA-LOC100505851：F：5′-TAC ACG CTT CCC TAT GTC ATC C-3′，R：5′-GCC TAT CCT ACT GTG TCC CTT-3′，擴增片段長度為462 bp。利用待測cDNA配置20 μL反應體系 [SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)：10 μL；PCR正向引物(10 μM)0.8 μL；PCR反向引物(10 μM)0.8 μL；ROX Reference Dye(50×)0.4 μL；cDNA溶液：2 μL；滅菌蒸餾水：6 μL]，進行PCR擴增，擴增條件為：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃延伸退火30 s，循環40次，每份樣品擴增3個孔，實驗重復3次。以β-actin為內參，得出ΔCt ，目標基因相對表達量以經過處理的樣本相對于未經處理的樣本的倍數表示，即檢測基因相對表達量=2-ΔΔC(ΔΔCt=ΔCt處理樣品-ΔCt未處理樣品)。

1.3 臨床資料收集及隨訪

收集所選取的80例HCC患者的性別、年齡等一般臨床資料及病例資料，采用TNM(tumor-node-metastasis)分期(第8版)[11]對術后所得的病理組織切片進行評估以確定各HCC患者肝癌TNM分期。在患者術后出院，根據自身病情接受放化療及護肝治療，采取門診或電話隨訪方式對患者病情持續跟蹤，頻次為3個月或半年1次，隨訪時間持續3年。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 HCC組織及癌旁組織lncRNA-LOC100505851的表達水平比較及診斷效能

80例HCC癌組織中，lncRNA-LOC100505851水平(0.57±0.23)低于對應的癌旁組織(P<0.05)；采用患者的HCC組織及癌旁組織中lncRNA-LOC100505851水平對HCC進行ROC曲線診斷，ROC曲線下面積(AUC)為0.863(P<0.05)，最佳截斷值為0.695，此時約登指數最大為0.563，靈敏度及特異度為0.825、0.738。見圖1。

2.2 HCC組織中分布的lncRNA-LOC100505851 表達同病理特征之間的相關性

依據ROC曲線，獲取最為理想的截斷值，作為臨界值，將HCC組織中lncRNA-LOC100505851 物質所呈現出的表達按高表達組(≥0.695)予以定義，并與低表達組(<0.695)進行比較，對lncRNA-LOC100505851 表達水平同臨床病理特征之間的關系進行分析，結果表明，HCC組織中lncRNA-LOC100505851 物質的表達同腫瘤位置、性別、年齡關聯性較小(均P>0.05)，同腫瘤體積大小、有無淋巴結轉移及TNM分期之間具密切相關性(P<0.05)，見表1。

表1 HCC組織中lncRNA-LOC100505851表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 HCC組織中lncRNA-LOC100505851表達與HCC預后的關系

對生存分析結果展開評估，lncRNA-LOC100505851物質高表達組在第1、2、3年所總生存率依次為100.00%、81.00%、61.90%，lncRNA-LOC100505851低表達組第1、2、3年的總生存率分別為88.10%、50.80%和39.00%；lncRNA-LOC100505851高表達組第1、2、3年的無瘤生存率分別為100.00%、66.70%和61.90%，lncRNA-LOC100505851低表達組第1、2、3年的無瘤生存率分別為83.10%、40.70%和39.00%，均低于 lncRNA-LOC100505851高表達組。見圖2。

2.4 HCC患者總生存時間的危險因素分析

單因素分析結果顯示，腫瘤大小≥5cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移和lncRNA-LOC100505851 低表達為罹患HCC的患者在總生存時間方面的危險因素(P<0.01或P<0.05)；依據多因素結果，腫瘤大小≥5cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和lncRNA-LOC100505851 低表達為HCC患者總生存時間的獨立預測因子(P<0.05)。見表2。

表2 單因素和多因素Cox 回歸綜合生存分析

3 討論

HCC作為最常見的一種肝癌病理類型，在病程早期，癥狀多呈隱匿顯示，患者在被臨床確診時，多已至病程晚期，且遠處轉移問題發生較早，同時，有較高的復發率，尚無可發揮根治性治療作用的方法。化療、放療、免疫靶向治療及手術切除等臨床治療手段均無法達到較理想效果，導致患者預后差[12]。隨著臨床綜合診斷、治療手段的改進及免疫靶向治療的發展，HCC患者的診斷與生存預后獲得了一定的提高，但尋找特異性較高的生物標志物對臨床HCC的早發現、早治療、生存預后仍然至關重要。

lncRNA為長度超過200nt的非編碼RNA，可在X染色體沉默中參與，同時參與基因組印記以及在染色質修飾環節，轉錄激活環節、干擾環節，核內運輸環節等其它多種重要且核心的調控過程[13-14]。lncRNA為包括肝癌在內的各種惡性腫瘤的重要調節因子，可作為預后評估指標及潛在的治療靶點[15-17]。在本研究所選取的80例HCC患者癌組織中lncRNA-LOC100505851水平為0.57±0.23，低于對應的癌旁組織的1.01±0.31。且繪制ROC曲線分析組織中lncRNA-LOC100505851表達水平對HCC結果的顯示，經對曲線下面積進行評估，為0.863，經對靈敏度參數及特異度參數進行評定，分別為0.825，0.738，對HCC的診斷價值較高。同時本研究根據ROC曲線所得最佳截斷值(0.695)將于HCC患者組織中分布的lncRNA-LOC100505851物質表達按高表達組與低表達組進行劃分，分析所表現出的表達水平同罹患HCC患者在臨床特征方面的相關性，結果表明，于HCC組織中分布的lncRNA-LOC100505851物質表達，同腫瘤體積大小、有無淋巴結轉移情況，及TNM分期之間關聯密切；且結合生存分析結果示，對于lncRNA-LOC100505851物質低表達組的患者，第1、2、3年的總生存率及無瘤生存率均低于lncRNA-LOC100505851 高表達組，該結果表明lncRNA-LOC100505851可作為HCC患者臨床治療預后的有效生物標志物。

本研究收集HCC患者的病例資料，進一步針對可對患者預后產生影響的因素展開Cox回歸方面的綜合生存層面的分析，單因素分析結果顯示，腫瘤大小≥5 cm，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期，淋巴結轉移與lncRNA-LOC100505851低表達為HCC患者總生存時間的獨立危險因素；多因素分析結果顯示，腫瘤大小≥5 cm，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期與lncRNA-LOC100505851低表達為HCC患者總生存時間的獨立預測因子，該結果再次證明lncRNA-LOC100505851可作為HCC患者臨床治療預后預測的有效指標。lncRNA作為基因表達過程中重要的調節因子，是目前腫瘤標志物研究的熱點之一。Zhang等[15]研究發現，lncRNA-ZNF385D-AS2與miR-96和miR-182間可能存在調節信號軸，其低表達預示著HCC患者預后不良；Xin等[16]研究表明，lncRNA HULC在人HCC中高度上調，與PTEN或miR15a的表達呈負相關，在HCC的發生過程中發揮重要作用；Yan等[17]指出，lncRNA-HAND2-AS1可介導SOCS5通過JAK-STAT通路延緩HCC的增殖和遷移。本研究表明lncRNA-LOC100505851在HCC患者臨床預后中至關重要。但本研究仍存在一定的局限性，譬如，未明確相關分子機制；僅分析了HCC患者的癌組織與癌旁組織，未對血清中lncRNA-LOC100505851水平進行檢測，同時未以肝炎患者血清中lncRNA-LOC100505851的表達作為比對。因此lncRNA-LOC100505851是否能夠區分HCC與肝炎仍需后續進一步研究。

綜上所述，lncRNA-LOC100505851在癌組織中的高表達與HCC患者的臨床病理特征密切相關，可延長患者生存時間，作為HCC患者預后評估和治療的潛在靶點。