上皮間質轉化在特發性肺纖維化及其信號通路中的研究進展

鄧玲玲 歐陽博書 魏 穎 董競成△

（1復旦大學附屬華山醫院中西醫結合科 上海 200040；2復旦大學中西醫結合研究院 上海 200040）

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種病因未明，成纖維細胞向肌成纖維細胞分化以及肺組織中細胞外基質過度積累的慢性進展性間質性纖維化肺炎，好發于60～70 歲的老年人，是臨床上最常見的間質型肺炎類型［1］，預后較差，中位生存期多為3～5 年，生存率甚至低于肺癌［2］。目 前IPF 的 治 療 藥 物 為2015 年 美 國FDA 批準的吡菲尼酮和尼達尼布，僅能改善患者癥狀，提高用力肺活量（forced vital capacity，FVC），不能延緩纖維化進展。越來越多的證據支持肺泡上皮細胞間質轉化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）在IPF 發病機制中的作用，本文對特發性肺纖維化中EMT 相關的主要信號轉導通路研究進展作一綜述。

EMT 定義EMT 是一種上皮細胞去分化為可分泌細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的間充質細胞，使纖維化病情長期存在，導致肺組織硬度增加［3］，上皮細胞失去頂端基底極性，減少細胞間黏附特性，獲得間質標記物如α-平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin ，α-SMA），N 鈣 黏 蛋 白（Ncadherin），波形蛋白（vimentin），EMT 相關轉錄因子的表達，以及細胞骨架的重組過程［4-5］。EMT 有3 種不同的功能類型：Ⅰ型與胚胎發育過程中組織和器官形成的生理過程有關；Ⅱ型為正常的傷口愈合，在IPF 中表現為肺部組織過度修復；Ⅲ型是指惡性上皮細胞獲得遷移性表型，與腫瘤的侵襲和轉移有關［5］。

EMT 在肺纖維化中的作用IPF 的組織病理學特征表現為肺基底部和側部的進行性瘢痕形成且呈不均勻性分布［6］。這些瘢痕區域的顯著標志是存在成纖維細胞簇（fibroblast foci，FF）——產生ECM 的成纖維細胞/肌成纖維細胞的集合［6］，位于正常和纖維化組織的邊界處，代表組織重塑或瘢痕增生的前沿［7］。多年來，關于IPF 成纖維細胞簇中成纖維細胞/肌成纖維細胞的來源一直存在爭議，大部分學者認為其主要來源于常駐組織成纖維細胞、骨髓源性祖細胞（所謂的纖維母細胞）和EMT來源的肺泡Ⅱ型上皮細胞（ATⅡ）［8］。在肺纖維化小鼠模型中進行的體內譜系追蹤實驗已證明，表達間充質標志物的細胞具有上皮來源特性［9］。來源于EMT 的成纖維細胞和肌成纖維細胞分泌胞外基質導致肺纖維化的進展，在肺纖維化的病理生理過程中發揮著關鍵作用［10］。因此，闡明EMT 相關信號通路，研究靶向EMT 的藥物可能是治療肺纖維化的主要途徑。

EMT 信號的激活組織微環境可以決定細胞是否發生EMT［11］。在慢性病中，損傷部位的微環境表現出乏氧、慢性炎癥、氧化應激、細胞因子分泌紊亂、胞外基質硬度增加等作為EMT 潛在的觸發因素。近年來內質網應激（蛋白質異常折疊）在肺纖維化的機制中研究緊密［12-13］。內質網應激是指細胞受到各種刺激導致胞內未折疊蛋白發生或折疊錯誤的蛋白質在內質網腔的積累，引發下游信號通路的激活，導致上皮細胞功能異常和肺纖維化［14-16］。研究表示過表達突變體的肺表面活性蛋白C（surfactant，pulmonary-associated protein C，SP-C）會觸發內質網應激和EMT［17］，內質網跨膜蛋白需肌醇酶1（inositol-requiring protein-1，IRE1）/X 盒結合蛋白1（X box-binding protein 1，XBP1）信號通路可通過介導轉錄因子snail 的表達促進EMT 的進展，從而引起纖維變性［18］。此外，越來越多的證據支持胞外基質的硬度增加不僅是纖維化的結果，而且可以誘導成纖維細胞的激活，正反饋加重纖維化的程度［19］。近期，唐楠團隊驗證了持續的胞外機械張力升高可以激活ATⅡ細胞中的TGF-β 信號環路，從而驅動了肺纖維化病理從周圍到中央的進展變化，高度模擬人體肺纖維化的病理特征，確立了肺泡再生受損、機械張力下降和進行性肺纖維化之間的直接機制聯系［20］。未來以細胞外基質為信號激活起始的新視角可能會極大地促進我們對IPF 和其他纖維化疾病的理解。

EMT 相關的信號通路研究顯示，調控EMT的信號轉導通路主要包括TGF-β-Smad、Wnt/βcatenin、Hippo、Notch、NF-κB 通路等（圖1），下面以前三個為例詳細介紹。

圖1 EMT 主要信號通路流程圖Fig 1 Flow chart of EMT related major signaling pathways

TGF- β -Smad 通 路 轉 化 生 長 因 子 β（transforming growth factor-beta，TGF-β）是 驅 動EMT 的 關 鍵 生 長 因 子。TGF-β 家 族 包 括3 個 轉 化生長因子β、2 個激活素（activins）、多種骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMPs）和其他配體的同二聚體和異二聚體，它們都通過跨膜雙特異性激酶受體（即充當Ser/Thr/Tyr 激酶的受體）的二元組合起作用［21］。肺泡上皮細胞通過整合素αvβ6結合潛伏的TGF［22］，活化TGFβ1，觸發信號蛋白Smad2/3 的磷酸化，與Smad4 形成復合物并易位入核［23］，結合轉錄因子SNAI1、SNAI2、ZEB、TWIST1等，并激活間充質基因的轉錄，例如α-SMA、Ncadherin、纖連蛋白和波形蛋白基因，促進上皮細胞重編程，朝著更具遷移性和間充質性的表型發展［4，24］。由上皮細胞產生的TGF-β1 在肺纖 維化中起 主 要 作 用，敲 除TGF-β1 可 以 減 輕 肺 纖 維 化［25］。此外，TGF 家族成員BMP-7 可直接抑制TGF-β 誘導的Smad 依賴性細胞信號轉導復合體在細胞核內的聚集和移動來逆轉EMT 過程［26-27］。吡菲尼酮作為治療肺纖維化的臨床用藥，主要通過抑制TGF-βsmad 通路發揮作用［28］。

TGF-β-nonSmad 通路 除了通過Smads 發出信號外，TGF-β 也可通過募集胞內信號介質如絲裂原活化蛋白激酶P38/MAPK/Erk、PI3K/AKT/mTOR 和Rho 家族的小GTPases 介導信號級聯傳遞，參與細胞增殖，分化和骨架重排［29-31］。在EMT早期，E3 泛素連接酶SMAD 泛素化調節因子1（SMAD ubiquitylation regulatory factor 1，SMURF1）被招募至PAR6，作為緊密連接的促溶劑，經TGF-β RII 磷酸化，分解細胞骨架蛋白，促進細胞的遷移性表型獲得［32］。許多證據表明，PI3K/Akt/mTOR 軸 在TGF-β 誘 導 的EMT 中 起 關 鍵 作用［33］。研究顯示mTORC1 促進細胞運動性和侵襲性并調節細胞體積大小。而mTORC2 可調節EMT相關的細胞骨架變化和基因表達［34］。使用AKT 的抑制劑會增加E-鈣黏蛋白的表達水平，減弱對Snail、波 形 蛋 白（vimentin，VIM）和α-SMA 的 表達［35-36］，替 卡 格 雷 可 以 通 過 介 導PI3K 通 路 抑 制EMT 進展，降低博來霉素誘導的大鼠肺纖維化［35］。

Wnt/β-catenin 通路 在肺纖維化中起作用的為經典Wnt/β-catenin 通路，在共受體低密度脂蛋白相關蛋白（lipoprotein-related protein，Lrp）5/6 的影響下，Wnt結合細胞表面受體Fzd，并與之形成三元復合物［37］，激 活 脫 鏈 蛋 白（disheled protein，Dvl），抑 制GSK-3β、β-catenin 發生磷酸化降解，使得β-catenin 在細胞質中積累，隨后進入細胞核，與TCF/LEF 基因家族的轉錄子結合，激活目標基因，促進細胞外基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）、促炎癥介質、生長因子等的表達［38］。在IPF 患者肺組織活檢樣本中發現ATII 中Wnt 3A、WISP1 表達上調，且在模型小鼠體內使用WISP1 特異性的中和抗體可減少細胞外膠原沉積，改善肺功能，下調與EMT 相關基因表達［39］。此外，使用特異性抑制β-catenin 信號轉導的小分子ICG-001 可減輕博萊霉素誘導的肺纖維化和EMT［40］。

Hippo 通路 Hippo 信號通路最早由果蠅遺傳篩選實驗發現［41］，當Hippo 信號通路激活時，下游的MOB1 和LATS1/2 在MST1/2 和SAV1 的 共 同 作用下發生磷酸化，從而激活MOB1 和LATS1/2，磷酸化下游YES 相關蛋白（yes-associated protein，YAP）和PDZ 結合基序（tafnzzin，TAZ），磷酸化的YAP/TAZ 與細胞質中的14-3-3 蛋白結合，隨后被β-轉導素重復序列包含蛋白（β-transducing repeatcontaining proteins，β-TrCP）泛素化降解，從而實現對細胞大小和體積的調控［42-43］。當Hippo 信號通路受到抑制時，YAP/TAZ 不能被泛素化降解，發生入核并與核內其他轉錄因子TEAD 結合，調節下游靶基因的表達［41］。Hippo 通路的核心轉錄效應子YAP/TAZ 是參與成纖維細胞活化和胞外基質形成的關鍵調節因子，其活性反映了細胞黏附和對細胞外基質機械信號刺激的反應能力，敲除YAP/TAZ可以減少成纖維細胞的收縮、增殖以及細胞外基質的合成［44］。最近一項研究發現骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSCs）內Snail/Slug-可與YAP/TAZ 形成復合體，參與MSCs 的自我更新和分化［45］，且在腎纖維化、心臟纖維化中觀察到活化的YAP 直接與TEAD 結合形成YAP-TEAD 異二聚體，介導EMT 的發生發展［46-47］。IPF 患者上皮細胞免疫熒光也顯示核YAP 的上調以及MST1/2 表達 的 缺 失［48］，YAP/TAZ 通 路 作 為 觸 發 肺 纖 維 化EMT 可能的作用靶點當進一步深入研究。

靶向EMT 的中藥IPF 是一種難以診斷的致命性間質性肺病，中藥治療肺纖維化逐漸被大家所認識。骨化三醇可抑制BLM 誘導的肺p38 MAPK和蛋白激酶B（Akt）的磷酸化，從而減弱EMT［49］。白藜蘆醇可通過抑制氧化應激和TGF-β1/Smad 信號通路改善LPS 誘導的EMT 和肺纖維化［50］。玉屏風散中提取的天然化合物玉屏風總糖苷YPF-G 可以通過減少HMGB1 激活和逆轉EMT 改善博來霉素誘導的肺纖維化［51］。芍藥苷依賴Smad 途徑，上調Smad7，降低轉錄因子Snail 的表達，抑制肺泡上皮細胞中TGF-β 引起的早期EMT［52］。黃芪甲苷通過抑制NLRP3 的表達降低肺纖維化上皮細胞間充質 轉 分 化［53］。穿 心 蓮 內 酯［54］、高 良 姜 素［55］、槲 皮素［56］、姜黃素［54，57］、燈盞乙素［58］等多項研究均顯示中藥活性單體可通過調控EMT，改善體內肺纖維化。

結語共表達上皮和間充質標志物細胞的存在表明了上皮細胞不一定是向產生ECM 的肌成纖維細胞的完全轉化，可能存在細胞的不完全轉化，存在雜合E/M 表型［59］。上皮細胞的可塑性應答，可視為細胞和細胞之間以及信號通路串擾的結果。除 上 文 提 及 的 通 路，Notch［60］，NF-κB［59］、Sonic Hedgehog（SHH）信 號 通 路［61］、缺 氧 誘 導 因 子1α（Hypoxia-inducible factors 1α，HIF-1α）［62］、過氧化物酶 體 增 殖 物 激 活 受 體 - γ （peroxisome proliferatoractivated receptor，PPAR）［63］，調 控miRNAs 的上皮剪接調節蛋白1/2（Epithelial splicing regulatory protein 1，ESRP1/ESRP2）相 關的信號轉導通路等［64-65］，都可不同程度上參與肺纖維化EMT 調節過程。總的來說，促進EMT 發生發展的最主要的通路仍是TGF-β-Smads 通路，但其余核心通路分子蛋白與TGF-β-Smads 信號轉導間的相互串擾，營造了促纖維化的微環境，觸發或增強了EMT，可成為下一步深入探索的方向。隨著基礎生物學的進展和新技術（如活體內成像技術，透明化技術，空間轉錄學等）的出現，以通路分子為靶點的治療將取得豐碩的治療成果。

作者貢獻聲明鄧玲玲 文獻檢索，綜述撰寫，繪圖。歐陽博書 文獻調研和修訂。魏穎 綜述構思和修訂。董競成 綜述審校。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。