無創產前基因檢測在產前篩查和診斷中的應用探討

胡彥麗

（臨洮縣人民醫院，甘肅定西 730500）

20世紀末期，美國著名科學家Lo等人在孕婦的外周血及羊水中發現了胎兒來源的DNA[1]，同時由于基因工程的基本實現，使得借助孕婦外周血及羊水中胎兒來源的DNA片段來對胎兒進行生物信息分析成為了可能，在這種情況下，無創產前基因檢測技術應運而生[2-7]。和其他類型的方法相比，該種方法完全無創，切實減輕了孕婦的痛苦，同時其準確率和靈敏度較高，因此在臨床上得到了越來越多產科專業醫師的認可。

對于新生兒來說，以染色體非整倍為代表的染色體異常是其出現缺陷的最主要原因，其中以21-三體綜合征（唐氏綜合征）為代表，因此做好產前篩查是保證優生優育、提升國民綜合素質的重要措施[8]。一直以來，在進行胎兒染色體異常的篩查和診斷是通過一篩查、二有創、三分析的步驟來進行的，按該流程進行檢查，不僅需要花費大量的時間和金錢，同時其中的有創檢查也會造成孕婦的痛苦，增加宮腔感染甚至流產的風險。當前，我國老齡化危機初現，政府鼓動群眾生二胎，“二孩政策”的提出使得醫院婦產科接收超過30歲的高齡產婦屢見不鮮，胎兒染色體異常篩查診斷的工作量也隨之增加[9]。另外，當前人們越來越重視醫學人文關懷，因此，尋找安全、操作簡單、痛苦小甚至無痛的新型產前篩查診斷技術迫在眉睫。有學者提出了無創產前基因檢測技術在胎兒異常染色體篩查方面的可行性，我院也開展了相應的研究。現將本次研究結果匯報如下。

一、資料與方法

（一）一般資料

本次研究選擇2018年1月至2020年1月我院因無創基因檢測結果異常并進行產前診斷的單胎妊娠孕婦共計200例作為研究對象，排除研究對象本身染色體異常，所有研究對象的年齡范圍在23～41歲之間，平均年齡為29.37±4.48歲，孕周范圍為19～35周，平均孕周為20.7±4.1周。所有的研究對象在本次研究中均進行了羊膜腔穿刺術。

（二）納入排除標準

研究對象納入標準：1.孕婦無創產前篩查結果異常；2.唐氏篩查提示高風險；3.孕婦的年齡超過35周歲；4.既往有生育染色體異常患兒的病史；5.配偶存在染色體結構異常；6.超聲檢查結果顯示軟指標異常。

研究對象排除標準：1.曾有先兆流產病史；2.在進行本次研究前連續兩次檢測體溫超過37.3℃；3.孕婦存在凝血功能障礙，穿刺操作可能造成出血；4.存在盆腔感染。

（三）研究方法

在本次研究中，對接受無創產前基因檢測結果提示染色體異常的300例孕婦進行羊水染色體核型分析以及染色體陣列分析。

第一，無創產前基因檢查。在進行無創產前基因檢查時，首先采用無菌采血的方法來對孕婦靜脈血進行采集，并通過分離血漿提取胎兒的游離DNA。對采取到的DNA樣本，采用末端修復、PCR培養以及純化等方法來建立一個完善的待檢測DNA數據庫。在進行DNA測序時，采用的是IonTorrent測序平臺開展和進行的，將獲取的DNA數據和正常人類的基因組參考序列進行對比，得到每個樣本的Z值，進而來對胎兒是否罹患染色體疾病以及罹患染色體疾病的風險進行評估。

第二，羊水染色體核型分析。進行羊水染色體的核型分析可以通過培養瓶法、核型分析法等方法來完成。培養瓶法是指對送檢的羊水標本進行離心，將上清液剔除，然后將沉渣放置于兩瓶容量為5ml的培養瓶內，其內裝有培養液，將其置于37.5℃的培養箱中進行為期7天的培養，記錄細胞的生長情況并進行細胞傳代換液，配置觀察玻片，觀察并記錄其G顯帶。而核型分析則是根據ISCN2016作為標準，對兩個培養瓶中20個及以上的中期分裂象進行觀察，并將其分為5個以上的核型，當出現2個及以上細胞系的增加時進行細胞計數，并將細胞的嵌合情況進行分析鑒定。

第三，染色體陣列分析。將獲取的研究對象羊水進行標本離心，摒棄上清液，提取沉渣，獲取羊水中胎兒的DNA，通過PCR技術進行擴增后對其進行酶切，將酶切后的片段和A-C750K芯片進行雜交和洗滌，然后將其置于掃描設備下，通過掃描軟件來獲取片段長度超過100kb且探針術超過50針的片段進行分析。此流程因醫院無法獨立完成，因此該步驟中將所有樣本均送至北京海斯特醫學檢驗實驗室，并由該實驗室操作完成檢測。

（四）觀察指標

本次研究對300例研究對象同時進行羊水染色體核心分析以及染色體陣列分析，對檢測結果呈陽性的研究對象，進行統計學分析以及無創產前基因檢測陽性病例的比對，觀察篩查結果的吻合程度。

二、結果

（一）無創基因檢測異常孕婦羊水染色體核型分析結果

采用無創基因檢測的方法以及羊水染色體核型分析21三體陽性的預測值超過80%，18染色體三體陽性的預測值為65%，13三體陽性的預測值為29.2%，性染色體異常陽性的預測值為40.8%，而其他類型染色體異常陽性的預測值為2.8%（表1）。

表1 異常孕婦羊水染色體核型分析顯示異常染色體核型及其預測值

（二）無創基因檢測檢查微重復微缺失和染色體微陣列分析結果

對于200例研究對象，在無創產前基因檢測結果異常的孕婦中發現存在染色體缺失及染色體片段重復的孕婦共計31例，借助微陣列分子核型分析技術檢測后發現有8例孕婦存在染色體異常，整體的陽性預測值為25.81%，而這8例染色體異常的孕婦當中，其中7例為具有致病性質的拷貝數變異，剩余1例的意義尚不明確。

三、討論

2012年，我國衛健委發布了《中國新生兒出生缺陷防治報告》，報告指出，現階段我國每年新增存在先天性缺陷的新生兒數量約為90萬例，發病率占所有新生兒的5.6%，而在這些缺陷兒當中，染色體疾病是主要的組成部分[10-12]。有學者的報道指出，染色體異常所致的疾病在胎兒娩出過程中死亡病例占5%～13%，在早期流產中的比例高達50%以上，現代醫學上不能夠對染色體疾病進行特異性治療，因此對孕婦進行產前篩查以及產前診斷是降低出生缺陷及染色體異常的主要預防措施[11-13]。

近年來，隨著基因測序等技術的不斷成熟，對高危染色體異常家庭進行無創產前篩查的應用也越來越廣泛，但是對于普通居民的應用尚沒有大規模地開展[14-15]。在本次研究中，通過對年齡超過35歲且對產前診斷存在抵觸情緒的高齡孕婦、唐氏篩查高風險群體、唐氏篩查臨界風險以及超聲檢查提示軟指標存在異常的孕婦進行無創產前篩查，結果顯示對于檢測出染色體異常具有非常重要的意義。因此，對于不適合接受有創產前診斷的孕婦，建議其在產檢期間常規接受無創產前篩查。無創產前篩查不僅能夠在染色體非整倍體篩查中具有較高的準確性和檢出率，同時隨著深度測序技術的不斷成熟以及無創產前篩查（高級別）的開展和普及，一些原本很少見的微缺失微重復檢測也開始在臨床上廣泛應用。有研究表明，無創產前篩查在篩查21號染色體、18號染色體、13號染色體以及性染色體時診斷的準確率較高，這和本次研究的結果是一致的。同時，有學者的研究指出，無創產前篩查能顯著提升性染色體異常的檢出率。在基于大規模平行測序的無創產前篩查當中，進行性染色體異常的檢查是具有較高可行性的。隨著深度測序的不斷發展以及人們對人類染色體結構了解的不斷加深，當分辨率達到100KB以后，借助無創產前篩查能夠將孕中期不易發現的染色體核型微小病變也檢測出來，尤其是對于微缺失微重復的風險預測也同樣具有實用性，但是該種檢測的靈敏度和特異性并不高。在本次研究中，通過采用無創產前篩查的微缺失微重復來對31例染色體異常的孕婦進行染色體微陣列分析，結果提示共有8例異常的病例，占比為25.81%，其中7例為具有致病性質的拷貝數變異，剩余1例為臨床意義尚不明確的拷貝數變異，提示該種染色體病變可能是由于家族性遺傳編譯所致，這和以往的研究結果并不一致。造成這種現象的原因除了家族性變異以外，還和研究樣本、孕婦羊水中提取到胎兒有利DNA的含量、染色體片段、測序的深度以及檢測方法等諸多因素均存在關系。