基于蛋白組學技術的駱駝乳和牛乳蛋白差異分析

◎ 江寶塔·穆哈德斯，木扎帕爾·木合塔爾，丁澤人

（1.新疆維吾爾自治區乳品質量監測中心，新疆 烏魯木齊 830063；2.新疆畜牧科學院畜牧業質量標準研究所，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆畜牧科學院飼料研究所，新疆 烏魯木齊 830011）

針對目前乳品市場上存在的駱駝乳品質良莠不齊、特種乳摻假等問題，對駱駝乳及駝乳制品制訂科學、有效的質量檢測措施，建立基于蛋白檢測的乳品質量監測系統，成為迫切需要解決的問題。本研究采用非標記（Label-free）定量蛋白質組學獲得駱駝和牛乳源蛋白（去除酪蛋白）表達的差異變化。Labelfree定量技術可通過液相色譜-串聯質譜（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry， LC-MS/MS）技術獲得的質譜圖譜峰和強度來計算蛋白質的數目和相對定量值，從而鑒定蛋白質種數和相對質量[1]。樣品上機檢測前處理過程少，更多地保留了原始樣本的信息。選擇該技術對樣本進行檢測的主要原因包括以下5方面。①樣品的類型不受限制，可對任意樣本進行蛋白質定量和分析，每個樣品可單獨上機處理。②樣本不需要特殊標記，排除了標記過程帶入的實驗誤差風險[2]。③對于單個樣本的蛋白總量要求相對較低，實驗周期短，實驗費用低[3-4]。④色譜和質譜具有較好的穩定性和重復性。⑤該技術可從蛋白的數量、表達差異及功能3個方面對樣本進行全面分析。本研究首先明確駱駝乳和牛乳蛋白質的種數差異，揭示駱駝乳與牛乳乳源蛋白的表達差異，并分析駱駝乳差異蛋白的功能及通路，為后續建立基于乳源蛋白分析的乳品質量檢測方法和評價體系提供有效的理論基礎和數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 檢測樣品采集與制樣

2021年10 月在新疆柴窩堡白楊溝村某駱駝和奶牛養殖戶分別隨機采集駱駝乳和牛乳各500 mL，冰盒保存送至實驗室；樣品在實驗室中液氮儲存后，放入裝有干冰的保溫盒送至新疆銘琮科技有限公司進行檢測。將采集的駝乳與牛乳依不同比例均勻混合制得檢測分析樣，每種檢測分析樣設3個平行樣，按順序標記并編號，見表1。

表1 樣本信息表

1.1.2 試劑

SDT緩沖液（4% SDS，100 mmol·L-1Tris-HCl，1 mmol·L-1DTT，pH 7.6）、SDT緩 沖 液（4%SDS，100 mmol·L-1DTT，150 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0）、UA緩沖液（8 mol·L-1尿素，150 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0）、碘乙酰胺（100 mmol·L-1IAA）、25 mmol·L-1碳酸氫銨緩沖液、BCA蛋白檢測試劑盒（Bio-Rad，美國）、0.1%（v∶v）甲酸、5X上樣緩沖液、12.5% SDS-PAGE凝膠、考馬斯亮藍R-250和84%乙腈。

1.2 儀器與設備

C18墨盒（Empore? SPE Cartridges C18，Sigma）、 紫外分光光度計（HACH）、電泳儀（biorad）、Q萃取 質譜儀（Thermo Scientific）和EASY-nLC系統（Thermo Fisher Scientific）。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋白質提取與消化

（1）蛋白質裂解與提取。將乳樣品加入SDT緩沖 液（4% SDS，100 mmol·L-1Tris-HCl，1 mmol·L-1DTT，pH7.6）進行蛋白質的裂解和提取。使用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白量[5]。

（2）蛋白質消化。胰蛋白酶的蛋白質消化按照MANN等[6]描述的過濾輔助樣品制備（Filter-Aided Sample Preparation，FASP）程序進行，具體步驟為每個樣品取200 μg提取的蛋白質置于30 μL的SDT緩沖 液 中（4%SDS，100 mmol·L-1DTT，150 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0）。接著加入UA緩沖液（8 mol·L-1尿素，150 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0）重復超濾 （Microcon units，10 kD），再加入100 μL碘乙酰胺 （100 mmol·L-1IAA）阻斷還原的半胱氨酸殘基，置于黑暗處孵育30 min。孵育后使用100 μL UA緩沖液洗滌過濾器3次，100 μL 25mmol·L-1碳酸氫銨緩沖液洗滌2次。最后將4 μg胰蛋白酶置于40 μL 25 mmol·L-1碳酸氫銨緩沖液，37 ℃過夜消化，收集得到的多肽作為濾液。每個樣品獲得的多肽在C18墨盒上脫鹽，真空離心濃縮，再加入40 μL 0.1%（v∶v）甲酸進行重組。使用280 nm的紫外光譜估計肽含量。

1.3.2 SDS-PAGE

每個樣品取20 μg蛋白分別與5X上樣緩沖液混合，煮沸5 min。蛋白質在12.5% SDS-PAGE凝膠（恒定電流14 mA，90 min）上分離。考馬斯亮藍R-250染色可見蛋白條帶。

1.3.3 液相色譜串聯質譜技術（LC-MS/MS）分析

LC-MS/MS分析在Q萃取質譜儀上進行，并耦合到液相系統EASY-nLC上120 min。將緩沖液A（0.1%甲酸）與多肽樣品裝載到與C18反向分析柱連接的反相捕集柱上，以緩沖液B（84%乙腈和0.1%甲酸）為線性梯度洗脫進行分離，流速為300 NL·min-1，采用IntelliFlow技術控制。質譜儀在正離子模式下工作以收集數據，儀器將選擇豐度最高的母離子進行二級質譜繪制，從調查掃描（300～1800m/z）中動態選擇最豐富的前驅體離子進行HCD片段化。自動增益控制（AGC）目標設置為3e6，最大注入時間設置為 10 ms。動態排除持續時間為40.0 s。在m/z200下的分辨率為70000，在m/z200下HCD光譜的分辨率設置為17500，隔離寬度為2m/z。歸一化碰撞能量為30 eV， 欠填充比定義為在最大填充時間內可能達到的目標值的最小百分比。該儀器運行時啟用了肽識別模式。

1.3.4 蛋白質的鑒定和定量

使用MaxQuant 1.5.3.17軟件對每個樣本的MS原始數據進行組合和檢索。

對照組與實驗組在IEMG貢獻率上具有高度的一致性。貢獻率比較高的下肢骨骼肌為股外側肌、脛骨前肌、股內側肌和股直肌。股外側肌、股內側肌、股直肌都屬于股四頭肌，可以使小腿伸，近固定時可以使大腿屈，遠固定時使大腿在膝關節處伸。太極拳練習中的弓步、虛步動作中的主要主動發力肌肉為股四頭肌，具有維持平衡或控制動作的作用，弓步和虛步中，也都需要脛骨前肌的收縮使踝關節跖屈。以上肌肉均屬于大腿和小腿的前群肌肉，因此，可以認為在太極拳運動中下肢骨骼肌的前群肌肉起主導作用，后群肌肉主要起協同、平衡和固定關節的作用。這表明，太極拳練習缺乏對股二頭肌、腓腸肌等大腿和小腿后群肌力的練習。

1.3.5 生物信息學分析

磷酸化多肽的聚類分析使用Cluster 3.0和Java Treeview軟件進行層次聚類分析。基序分析采用MeMe分析。亞細胞定位采用CELLO分類系統[7]。域注釋使用InterProScan軟件搜索蛋白質序列，以從InterPro成員數據庫Pfam中識別蛋白質結構域簽名[8]。GO注釋利用NCBI BLAST+客戶端軟件（NCBIBLAST-2.2.28+-win32.exe）和InterProScan軟件對所選差異表達蛋白的蛋白序列進行局部搜索，尋找同源序列，然后利用Blast2GO軟件繪制基因本體（GO）術語并進行序列注釋[9]。GO注釋結果由R語言繪制。KEGG注釋按照注釋步驟，將研究的蛋白質通過京都基因和基因組百科全書（KEGG）在線數據庫（http://geneontology.org/）檢索其KEGG orthology標識，并隨后映射到KEGG中的通路[10]。富集分析Fisher精確檢驗。蛋白質-蛋白質相互作用分析通過基因符號或STRING軟件從完整分子相互作用數據庫中檢索，結果以XGMML格式下載并導入Cytoscape軟件進行可視化。

2 結果與分析

2.1 蛋白質鑒定結果統計

單個樣本的蛋白質鑒定數量統計見表2。本研究實驗組共計鑒定出800個蛋白質。通過使用韋恩圖分析組間樣本之間蛋白質的重疊情況，發現共有264個蛋白質發生重疊，實驗組間具有多個差異蛋白質（圖1）。

圖1 組間蛋白質鑒定結果Venn圖

表2 蛋白質鑒定結果統計表

2.2 蛋白表達差異結果數量統計

以FC＞2倍且P＜0.05為標準，篩選顯著性差異蛋白質；以蛋白質存在于同一組樣本中2個或以上平行樣本，但不存在于另一組樣本為標準，篩選有/無差異蛋白質。由表3和圖2可知，C10與M10相比，顯著性差異蛋白表現上調的有89個，其中接近一半的蛋白質（43/89，48.31%）差異倍數＞10倍；表現下調的有19個，其中26.32%（5/19）的蛋白質差異倍數＞10倍。C9、C8和C7與M10相比，顯著性差異表現上調或下調的蛋白質種數均與C10與M10相比的結果相似。對5個分組之間比較差異表達蛋白，結果顯示，共計136個蛋白質可以區分不同實驗組，包括α-乳清蛋白（Alpha-lactalbumin）、乳清酸性蛋白（Whey acidic protein）和載脂蛋白C-II（Apolipoprotein C-II）等。

2.3 顯著性差異蛋白質聚類分析

采用凝聚層次聚類算法對實驗組的差異表達蛋白質進行分組歸類，結果表明本研究的實驗分組合理有效，擇取的差異表達蛋白具有代表性。由圖3可知，C10與C9的差異表達蛋白質區分不明顯，但C8、C7較為直觀地顯示約1/3的差異表達蛋白表現下調。C10與M10相比，牛乳中表現上調的差異表達蛋白質在駱駝乳中的表達量較低。表明駱駝乳與牛乳的差異表達蛋白類別可有效區分駱駝乳品質，此發現可為建立駱駝乳源檢測技術提供可靠的數據基礎。

2.4 差異表達蛋白的亞細胞定位分析

由圖4可知，對比5個分組的差異表達蛋白亞細胞定位，其中有59個蛋白質定位于細胞質（Cytoplasmic），42個蛋白質定位于細胞外（Extracellular），40個蛋白質定位于細胞核（Nuclear），13個蛋白質定位于細胞膜（Plasma Membrane），9個蛋白質定位于線粒體（Mitochondrial），3個蛋白質定位于溶酶體（Lysosomal），2個蛋白質定位于過氧化物酶體（Peroxisomal），2個蛋白質定位于內質網（ER），另外2個定位于其他細胞器。了解差異表達蛋白定位的亞細胞結構，可為后續建立基于乳源蛋白的駱駝乳及駝乳制品質量檢測提供檢測位點區域的選擇，以便制造或研究出方便、快捷、高效的檢測試劑。

圖4 5個實驗組差異表達蛋白質亞細胞定位餅圖

2.5 差異表達蛋白結構域分析

由圖5可知，位于Ras家族（Ras family）結構域的蛋白質種數最多，含有9個，其次是Hsp70蛋白（Hsp70 protein）結構域、β-酮酰基合成酶，N-端 結 構 域（Beta-ketoacyl synthase，N-terminal domain）、α-2-巨球蛋白家族（Alpha-2-macroglobulin family）結構域和14-3-3蛋白（14-3-3 protein）結構域等。由圖6可知，酮酰基-合成酶C-末端延伸（Ketoacyl-synthetase C-terminal extension）、聚酮合酶脫水酶（Polyketide synthase dehydratase）、kringle domain（KR domain）、β-酮酰基合成酶，C-端結構域（Beta-ketoacyl synthase，C-terminal domain）、酰基轉移酶結構域（Acyl transferase domain）、β-酮酰基合成酶，N-端結構域（Beta-ketoacyl synthase，N-terminal domain）這5個結構域的蛋白富集度顯著性較高。

圖5 5個實驗組差異表達蛋白質結構域分析圖

圖6 5個實驗組結構域富集分析圖

Domain Name（Top 20）為結構域名稱（蛋白質數目排名前20）；The number of Proteins為蛋白質數 目；Domain Analysis為結構域分析。

2.6 差異表達蛋白的GO功能分析

一般情況下，差異表達蛋白的種數在某一功能類別越多，表明該功能越重要。以GO功能在Ontologies的樹形分支結構中所處的2級層次注釋結果進行統計，生物過程（Biological Process，BP）中細胞轉化（Cellular process）、生物調節（Biological regulation）、刺激反應（Response to stimulus）、代謝過程（Metabolic process）和生物過程的調控（Regulation of biological process）等18個類別的蛋白質種數相對較多（均＞2）；分子功能（Molecular Function，MF）中結合功能（Binding）、催化活性（Catalytic activity）和分子功能調節（Molecular function regulator）等5個類別的蛋白質種數相對較多（均≥2）；細胞組分（Cellular Componen，CC）中細胞外區域（Extracellular region）、細胞（Cell）、細胞區域（Cell part）、細胞器（Organelle）和細胞外區域組分（Extracellular region part）等14個類別的蛋白質種數均居多（均＞2）（圖7）。說明駱駝乳中差異表達蛋白質與生物體機體能量代謝調節與組織修復過程緊密相關。

圖7 5個實驗組差異表達蛋白質的GO注釋統計圖（Level 2）

篩選出Top 20顯著富集的GO條目，由圖8可知，BP中顯著富集的GO條目為細胞器定位的建立（Establishment of organelle localization）；MF中 顯著富集的GO條目為氧化還原酶活性（Oxidoreductase activity）；CC中顯著富集的GO條目為黏附連接（Adherens junction）。這些具有高顯著水平富集度的GO功能類別下的蛋白質在進一步研究駱駝乳差異表達蛋白質的生物學實驗驗證或機制研究中具有重要意義。

圖8 5個實驗組GO功能富集Top 20柱狀圖

2.7 差異表達蛋白的KEGG功能分析

由圖9可知，5個實驗組間參與細胞內吞作用（Endocytosis）的差異表達蛋白質最多，屬于運輸和分解代謝（Transport and catabolism）途徑，此可能與駝乳相比于牛乳更能改善機體脂肪、糖代謝能力相關；PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathwa）和肌動蛋白細胞骨架的調控（Regulation of actin cytoskeleton），分別屬于信號轉導（Signal transduction）和細胞蛋白（Cell motility）途徑，此可能與駝乳相比于牛乳具備更好的細胞修復，促進已損害胰島β細胞功能恢復能力相關；進一步分析差異表達蛋白質在代謝通路中的富集特征，實驗組間顯著富集在AMPK信號通路（AMPK signaling pathway）（圖10），以其進行可視化展示，可見多個駱駝乳專屬差異表達蛋白（圖11，無背景色邊框），包括PP2A、HMGR、HSL等。明確差異表達蛋白的信號通路及其所在信號通路中的位置，可為建立駱駝乳及駝乳制品質量標準篩選出個性化、可靠的蛋白檢測提供詳盡的數據基礎，同時可為后續進一步研究功能性乳制品提供依據。

圖9 5個實驗組差異表達蛋白質的KEGG通路注釋及歸屬柱狀圖

圖10 5個實驗組KEGG通路富集氣泡圖

圖11 5個實驗組差異表達蛋白的AMPK信號通路圖

2.8 差異表達蛋白的互作網絡分析

根據差異表達蛋白的聚集程度，將其分為5個簇，每個簇中的蛋白質具有相同/相似的功能（圖12）。A0A5N4EFP0蛋白的連接度最高，其所在KEGG通路為甲狀腺激素合成通路（Thyroid hormone synthesis），屬于血清白蛋白，該蛋白發生變化可能會使系統受到干擾，是維持系統平衡和穩定的關鍵，從系統生理學上看，駝乳與牛乳相比，差異蛋白A0A5N4EFP0緊密連接的甲狀腺激素合成通路對機體腦、骨骼、神經發育，神經系統雙向調節，糖、脂肪代謝，組織細胞蛋白合成以及心血循環系統穩定等緊密相關，此為駝乳新功能探索提供了參考。互作網絡分析還發現具有其他的蛋白質在生物學調控中發揮重要作用，為駱駝乳及駝乳制品質量檢測方法的建立提供了更為清晰的蛋白選擇方向。

圖12 5個實驗組間差異表達蛋白質相互作用網絡歸類圖

3 結語

通過Label-free定量蛋白質組生物信息學分析對實驗組的蛋白質種數、差異蛋白表達及其功能進行全面分析，對不同配比駱駝乳和牛乳間蛋白質的差異有初步的了解。①100%駱駝乳的蛋白質種數是100%牛奶蛋白質種數的近3倍，加入了10%、20%、30%牛奶的駱駝乳蛋白質種數略微減少，從蛋白質種數檢測上無法有效區分駱駝乳品質。②5個實驗組間的差異表達蛋白共有136個，包括α-乳清蛋白、乳清酸性蛋白和載脂蛋白C-II等，這些蛋白質的檢測均可有效地區分不同品質駱駝乳及駝乳制品。③差異表達蛋白功能分析顯示，駱駝乳差異表達蛋白的功能類別豐富，附含在多個信號通路上，這些通路與抗糖尿病、促進傷口愈合、增強肌肉力量、抗菌抗炎、促進骨骼生長、內分泌激素調節、神經營養以及代謝調節等有關。

本研究為駱駝乳及駝乳制品的質量檢測提供了方向，后續可利用已獲得的差異蛋白及其表達量差異和功能差異信息建立檢測技術，挖掘出可廣泛應用于駱駝乳及駝乳制品加工過程中質量檢測、貨品出廠檢測及市場監督檢測且高效、快速、便捷、節約成本的檢測試劑或試紙。此外，可利用差異蛋白功能信息更深入研究其對機體健康功能的影響，駱駝乳的差異蛋白功能涉及生物體的生長、代謝、免疫和疾病等多個方面，駱駝乳中的差異蛋白對不同人群的體質、健康功能狀態的影響值得探討。基于駝乳牛乳差異蛋白研究的相關功能性的駱駝乳制品和涉及機體代謝、神經系統調節的醫用藥品均有待進一步的探索。