響應(yīng)面法優(yōu)選川芎醇提工藝*

劉雨晴，景炳年，謝曉陽，魏 磊，李 建，張華南，王 韜，朱 杰，劉冠華，陳 飛

（1.河南省科學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省納普生物技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450002）

川芎Ligusticum chuanxiongHort.是多年生、傘形科藁本屬植物，廣泛分布于四川、廣西、貴州、湖北及云南等地［1］，藥用部位為干燥的根莖。《外臺(tái)秘要方》收錄美容方劑363首，包括外用方和內(nèi)服方，其中川芎是唯一入藥頻次均為前5的中藥［2］。川芎粗提物可抑制酪氨酸酶活性，從而起到抑制黑色素生成的作用［3-7］。本研究中以阿魏酸得率為考核指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法綜合分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間4個(gè)最佳工藝參數(shù)［8-12］，優(yōu)選川芎醇提取工藝，以期為川芎植物資源在化妝品方面的充分、合理開發(fā)提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

KQ-500E型超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）；UV-3802型紫外可見分光光度計(jì)（尤尼柯<上海>儀器有限公司）。

1.2 試藥

阿魏酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110773-201915，含量≥98%）；試驗(yàn)所用試劑均為分析純。川芎藥材購自河南鄭州中藥批發(fā)市場，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠明教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 阿魏酸含量測定

2.1.1 溶液制備

取阿魏酸對照品2.33 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入甲醇超聲（功率500 W，頻率40 kHz，下同）處理20 min，濾過，取續(xù)濾液，即得對照品溶液。取藥材樣品粗粉適量，精密稱定，置500 mL錐形瓶中，加入提取溶劑超聲處理20 min，重復(fù)3次，合并3次濾液，抽真空旋轉(zhuǎn)濃縮，以甲醇定容至50 mL，即得供試品溶液。

2.1.2 最大吸收波長確定

取阿魏酸對照品溶液，置1 mL比色管中，進(jìn)行200～400 nm波長全掃描，獲得吸收光譜圖，確定其最大吸收波長為320 nm，故以此為檢測波長。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察［13］：取阿魏酸對照品溶液0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL，分別置25 mL容量瓶中，依次加入甲醇6 mL、0.3%十二烷基硫酸鈉2 mL、0.9%鐵氰化鉀-0.6%三氯化鐵（1∶1，V/V）混合液1 mL（現(xiàn)配現(xiàn)用），充分搖勻，暗處放置5 min，加入1 mol/L冰醋酸溶液定容至25 mL，搖勻，暗處放置30 min，測定320 nm波長處的吸光度。以阿魏酸質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得阿魏酸回歸方程為Y=199.27X+6.70（R2=0.994 6，n=6）。結(jié)果表明，阿魏酸質(zhì)量濃度在2.83～6.60 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

其他：按相關(guān)要求進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度、溶液穩(wěn)定性、方法重復(fù)性均良好。

2.2 單因素試驗(yàn)

乙醇體積分?jǐn)?shù)：分別以體積分?jǐn)?shù)為35%，50%，65%，80%，95%的乙醇，料液比為1∶20（g/mL），160℃下超聲提取60 min。結(jié)果阿魏酸得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈先升后降的趨勢，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)得率最高，故選擇80%乙醇進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。詳見圖1 A。

圖1 單因素試驗(yàn)考察結(jié)果A.Volume fraction of ethanol B.Solid-liquid ratio C.Ultrasonic temperature D.Ultrasonic timeFig.1 Results of the single factor test

料液比：分別以料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），80%乙醇，160℃下超聲提取60 min。結(jié)果阿魏酸得率隨料液比的增大呈先升后降的趨勢，當(dāng)液料比為1∶20（g/mL）時(shí)得率最高，故選擇料液比1∶20（g/mL）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。詳見圖1 B。

超聲溫度：以80%乙醇，料液比1∶25（g/mL），分別在30，40，50，60，70℃下超聲提取60 min。結(jié)果阿魏酸得率隨超聲溫度的升高呈先升后降的趨勢，當(dāng)溫度為60℃時(shí)得率最高，故選擇超聲溫度60℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。詳見圖1 C。

超聲時(shí)間：以80%乙醇，料液比1∶25（g/mL），在60℃下分別超聲提取20，40，60，80，100 min。結(jié)果阿魏酸得率隨超聲時(shí)間的延長呈先升后降的趨勢，當(dāng)超聲80 min時(shí)得率最高，故選擇超聲80 min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。詳見圖1 D。

2.3 響應(yīng)面法

試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、超聲溫度（C）和超聲時(shí)間（D）為自變量，阿魏酸得率為響應(yīng)值，采用4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)，因素與水平見表1，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and their levels

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Tab.2 Design of the Box-Behnken test

模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)：采用Design-Expert 12數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件對試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸、擬合，得二次多項(xiàng)回歸模型為，Y=0.098 2+0.0081A+0.0046B+0.0030C+0.0056D+0.0043AB+0.000 0AC+0.002 6AD+0.002 2BC+0.003 3BD-0.001 7CD-0.015 7A2-0.018 4B2-0.003 9C2-0.002 2D2。

結(jié)果分析：由表3可見，對結(jié)果的影響，一次項(xiàng)A，B，D極顯著（P<0.01），C顯著（P<0.05）；二次項(xiàng)A2，B2極顯著（P<0.01），C2，D2不顯著（P>0.05）。試驗(yàn)因素系數(shù)F=16.80（P<0.000 1），說明該模型擬合程度良好，回歸極顯著，總決定系數(shù)R2=0.943 8，校正決定系數(shù)R2Adj=0.887 6。結(jié)果表明，回歸模型可很好地描述川芎醇提工藝各因素與阿魏酸得率之間的關(guān)系。

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Results of the ANOVA

響應(yīng)面交互作用：為確定上述4因素及其交互作用對川芎阿魏酸得率的影響，根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面圖。4個(gè)因素之間雙因素交互作用的響應(yīng)面均為開口向下的凸形曲線，表明試驗(yàn)范圍內(nèi)阿魏酸得率的響應(yīng)值存在極高值，即醇提最優(yōu)條件存在于所設(shè)計(jì)的因素水平范圍之內(nèi)。詳見圖2。

圖2 各因素對川芎阿魏酸得率影響的響應(yīng)面圖A.Solid-liquid ratio and volume fraction of ethanol B.Ultrasonic temperature and volume fraction of ethanol C.Ultrasonic time and volume fraction of ethanol D.Ultrasonic temperature and solid-liquid ratio E.Ultrasonic time and solid-liquid ratio F.Ultrasonic time and ultrasonic temperatureFig.2 RSM plots of the influence of various factors on the yield of ferulic acid from Ligusticum chuanxiong

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

川芎最佳醇提工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為80.68%，料液比為1∶21.77（g/mL），超聲溫度62.68℃，超聲時(shí)間60 min。在此條件下，川芎阿魏酸得率的理論預(yù)測值為0.098%。為進(jìn)一步確認(rèn)本研究響應(yīng)面結(jié)果的可靠性，并充分考慮實(shí)際可操作性，將最佳提取工藝參數(shù)修正為，80%乙醇、料液比1∶21（g/mL），在63℃下超聲提取60 min。川芎阿魏酸的實(shí)際平均得率為（0.096±0.02）%（n=3），與理論預(yù)測值0.098%相對誤差較小。

3 討論

阿魏酸是川芎藥材的重要活性成分之一。本研究中最佳醇提工藝經(jīng)3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，阿魏酸實(shí)際得率與模型理論預(yù)測結(jié)果相對誤差較小，優(yōu)化工藝參數(shù)穩(wěn)定可靠。阿魏酸可溶于乙醇及乙酸乙酯，脂溶性較小，本研究中80%乙醇為超聲提取的最佳溶劑，與阿魏酸的上述特性相互印證。

川芎最佳醇提取工藝條件為，以80%乙醇、料液比為1∶21（g/mL），在63℃下超聲提取60 min。實(shí)際測得的阿魏酸平均得率為（0.096±0.02）%，與理論預(yù)測值（0.098%）相對誤差較小。

綜上所述，優(yōu)化后的川芎醇提工藝穩(wěn)定可行，可為川芎開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。