錦鯉人工感染SVCV后血液生化指標監(jiān)測及在疾病診斷中的應用分析

劉文珍，田飛焱，花麒，歐陽敏

（1.江西省農(nóng)業(yè)技術推廣中心，江西 南昌 330046；2.江西省水產(chǎn)科學研究所，江西 南昌 330039；3.江西省水生生物保護救助中心，江西 南昌 330046）

鯉春病毒血癥病毒（SVCV），是一種彈狀病毒，在春季常能夠引起鯉科、鯰科魚類大規(guī)模爆發(fā)鯉春病毒血癥（SVC）[1]。SVC主要表現(xiàn)為急性出血和流行性敗血癥，傳染快，死亡率高，曾在歐洲、美國、日本流行，染病魚類死亡率高達90%以上，可造成巨大的經(jīng)濟損失[2][3]。SVC在世界范圍內(nèi)流行，由于該病對水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展可造成極大的威脅，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將該病列為必須申報的疫病[4]，我國也于2008年將該病列為一類動物疫病。

SVCV的宿主范圍很廣，能感染四大家魚和其他幾種鯉科魚類以及某些非鯉科魚類，如鯉魚。其中鯉魚是最主要的、最易感染的宿主。但迄今為止，對SVC的研究僅局限于病原學、流行病學調(diào)查、檢測與診斷以及單基因水平的分子學生物研究，而關于其感染后的血液生化指標研究還很少，本文中就用實驗室分離出來的一株SVCV對錦鯉進行人工感染，引發(fā)其病癥，測定該錦鯉的血液生理生化指標，以期為錦鯉的鯉春病毒血癥的病理學研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

用于人工感染試驗的試驗魚購自于分宜縣某養(yǎng)殖場，為體長在11～15 cm健康錦鯉（Cyprinus carpio koi）；水族箱用循環(huán)水中暫養(yǎng)5 d，無異常后開始試驗。SVCV病毒株是本實驗室利用草魚卵巢細胞系從一批鯽監(jiān)測樣品中分離鑒定到的一株病毒，為JX14-012株。

1.2 方法

1.2.1 人工感染

試驗前隨機抽取該批錦鯉25尾，取肝、脾、腎和腦按前述方法進行病毒分離和PCR檢測，確定試驗魚為SVCV陰性樣本。然后將剩下的魚隨機分成4組，每組15尾，暫養(yǎng)于室內(nèi)水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)的4個水缸中，水溫為8℃～16℃。以JX14-012株的細胞懸液作原液，并將原液用含10%胎牛血清的M199以1∶10倍、1∶100倍稀釋，共3個梯度的攻毒液通過腹腔注射試驗組，同時用正常的CO細胞懸液注射另一組作為對照組，每尾注射0.2 mL，每天觀察各組試驗魚的發(fā)病死亡情況，試驗過程中開增氧機、不開循環(huán)水。為了驗證第一次感染試驗的試驗結果，又進行了第二次感染試驗，將原液用含10%胎牛血清的M199以1∶10倍、1∶100倍稀釋，共3個梯度的攻毒液通過腹腔注射試驗組，同時用正常的CO細胞懸液注射另一組作為對照組，每尾注射0.2 mL。

1.2.2 血液生化指標測定

用無菌注射器（1 mL）進行尾靜脈取血，置于1.5 mL離心管中，用低溫冷凍離心機，10000 r/min離心10 min，收集血清，分別測定健康錦鯉、受感染2 d和9 d的錦鯉血清中的總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、總膽固醇（TC）、尿素氮（BUN）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）、尿酸（UA）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酐（CREA）、葡萄糖（GLU）、球蛋白（GLB）。所有生化指標均在URIT-8026生化自動分析儀上完成。第二次感染試驗感染6 d后（出現(xiàn)明顯癥狀甚至死亡）抽血測定以上相同指標。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗數(shù)據(jù)均通過Spss 24軟件進行統(tǒng)計分析。進行ANONA分析，多重比較，P＜0.05即認為差異顯著，所有的數(shù)據(jù)結果以樣本平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀

感染SVCV的魚類一般有以下癥狀：在池塘進水口聚集、活力下降、呼吸困難；隨后病魚出現(xiàn)反應遲鈍、游速減慢、身體平衡能力降低，有些在池塘邊緣無方向性的游動或無意識漂游；發(fā)病后期病魚幾乎停止游動，身體傾斜，經(jīng)常臥于池底[5，6]；病魚體色發(fā)黑、眼球突出、鰓部蒼白等，眼球和體表有出血斑點，肌肉呈紅色[4]。在本試驗中注射感染的錦鯉在第6天開始出現(xiàn)典型癥狀，主要表現(xiàn)為全身出血，眼球突出（圖1）、解剖病魚，發(fā)現(xiàn)鰾充血較為明顯，肛門紅腫，腹腔積水、肝脾腎腫大（圖2）。而對照組魚無病癥。

圖1 體表、鰓蓋、頭部充血現(xiàn)象

圖2 鰾充血癥狀

2.2 感染SVCV對錦鯉血清生化指標的影響

由表1可知，人工感染后，與健康組相比較，TBIL、DBIL、TC、ALT、AST、ALP、GGT均無顯著性差異，但仍然能從表中看出一些變化的規(guī)律，其中TBIL、DBIL在血清中的含量在感染2 d時有稍微的上升，在感染9 d后則有所下降，ALT、AST、ALP則均在感染2 d時數(shù)值變化不大，感染9 d后則含量有所上升。

表1 健康魚與人工感染后魚的血液生化指標的比較

TP、ALB、GLB、HDL、LDL均在感染后濃度有所下降，但沒有顯著性差異，而是感染9 d后，血清中含量顯著下降，與健康組相比較有顯著性差異（P＜0.05）。

TG、UA則在感染2 d后濃度迅速上升，尤其是原始濃度感染組和稀釋10倍原液感染組，與健康組相比較有極限性差異（P＜0.01），但在感染后期，則其濃度極大的降低到與健康組濃度差異不大。

LDH、CREA、GLU均在感染初期變化不明顯，但在感染9 d后，含量均極顯著升高。

BUN在感染2 d后其濃度就迅速下降，至感染9 d后，其濃度與健康組相比較有極顯著性差異（P＜0.01）。

由表2中可以看出第二次的試驗基本驗證了第一次感染試驗的結果，TBIL、DBIL、TC、ALT、AST、ALP、GGT、TG、UA均無顯著性差異，其中TG、UA符合第一次感染試驗時感染初期變化明顯而感染后期變化不明顯的規(guī)律。而TP、ALB、GLB、HDL、BUN含量則顯著下降，LDH、GLU、CREA在感染后含量顯著上升，均與第一次感染試驗結果一致。

表2 第二次感染試驗后錦鯉的血液生化指標比較

3 討論

3.1 關于血液生化參數(shù)變化及生理意義的分析

綜合兩次感染試驗可以看出，在感染初期（2 d左右），與正常值相比較，只有TG、UA、BUN三個指標變化明顯，其中UA、TG后期并無顯著性變化，因此建議可以使用TG、UA、BUN三個指標做為SVC疾病初期的診斷參考指標。而在感染后期（6～9 d），與正常值相比較，TP、ALB、GLB、HDL、LDH、GLU、CREA均有明顯變化，可以做為SVC疾病后期的診斷參考指標，此時有些錦鯉也開始出現(xiàn)一些典型癥狀，這與錦鯉血液生化指標的變化相對應。

3.2 個別參數(shù)變化及生理意義分析

如，錦鯉受到病毒攻擊，肌肉充血，肌肉組織受到破壞，肌酸代謝產(chǎn)物CREA在血清中含量明顯增加，表明肌肉組織受損嚴重。LDH含量增高，也是錦鯉肌肉組織受損的表征，這能加速受感染錦鯉的死亡。血液中的ALB主要功能是維持血液的滲透壓，GLB主要參與脂類和溶脂類物質(zhì)的運輸以及機體免疫反應。而兩者之和的TP是機體蛋白質(zhì)的來源，常用于修補組織和能量補給。本試驗中TP、白蛋白、球蛋白均在感染后濃度下降，尤其是感染9d后，血清中含量顯著下降，與健康組相比較有顯著性差異，這說明肝細胞受損蛋白質(zhì)合成功能減退，這是反映魚體受病毒攻擊的重要指標。因此，檢測錦鯉的血液生化指標能夠在錦鯉的疾病診斷中起到重要的作用。