補腎健脾方對db/db小鼠糖代謝及骨代謝的影響

劉峰，羅冬強，王珍

（1.廣東祈福醫院，廣東 廣州 511495；2.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405）

糖尿病是以血糖升高為主要表現的代謝性疾病。大量研究發現，糖尿病患者同時存在骨代謝紊亂，易合并骨質疏松。流行病學調查顯示，高達21.1%的糖尿病人群伴發骨質疏松性骨折[1]，糖尿病患者的骨折風險明顯超過非糖尿病人群[2]。目前，骨質疏松及骨折已被視為老年糖尿病患者的一個重要并發癥，即使在年輕的2型糖尿病患者人群中，骨質疏松性骨折也不少見[3]。補腎健脾方是本科協定方，該方具有降低2型糖尿病患者血糖、糖化血紅蛋白[4]，改善患者胰島功能[5]，增加2型糖尿病患者骨密度[6]等臨床療效。因此，本研究旨在觀察補腎健脾方對db/db小鼠糖代謝及骨代謝指標的影響，探討該方降糖及增加骨密度可能的作用機制，以期為該方在2型糖尿病合并骨質疏松治療中的應用提供理論依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物4周齡雄性db/db陽性小鼠16只，BKS背景陰性小鼠8只，體質量約20 g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，生產許可證號：SCXK（蘇）2018-0008。動物實驗通過廣東祈福醫院倫理委員會批準。

1.2 藥物、試劑與儀器補腎健脾方由淫羊藿12 g、鹿角膠15 g、黃精12 g、沙苑子15 g、制首烏15 g、黃芪30 g、山藥30 g、葛根30 g、丹參30 g、制大黃10 g組成。以上中藥飲片均購自廣東祈福醫院中藥房，加工成凍干粉。小鼠脂聯素（APN）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、小鼠胰島素ELISA試劑盒、小鼠25-羥基維生素D3[25-（OH）D3]ELISA試劑盒、小鼠Ⅰ型前膠原氨基端原肽（PINP）ELISA試劑盒（武漢基因美科技有限公司）；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）染色試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）；Bax抗體、Bcl-2抗體、Caspase-3抗體、山羊抗兔IgG（北京中杉金橋公司）。酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；電熱恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）；RM2016切片機（上海徠卡儀器有限公司）；DM500光學顯微鏡（德國Leica公司）。

1.3 分組與給藥將16只雄性db/db陽性小鼠隨機分為治療組和陽性對照組，每組8只；8只BKS背景陰性小鼠作為陰性對照隨機分為陰性對照組1和陰性對照組2，每組4只。適應性飼養1周，治療組和陰性對照組1給予補腎健脾方凍干粉溶液9.95 g/kg灌胃，每日2次；陽性對照組和陰性對照組2給予等體積生理鹽水灌胃，每日2次。連續給藥4周。

小鼠灌胃劑量計算方法：中藥按20%出粉率計算，補腎健脾方凍干粉人體用量為0.796 g·kg-1·d-1，按小鼠用藥量為人體用藥量25倍計算小鼠用藥量為19.9 g·kg-1·d-1。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 血液指標檢測灌胃4周后，斷頸處死小鼠，腹主動脈取血，檢測小鼠血清血糖指標，按試劑盒說明書采用ELISA法檢測血清胰島素、APN、25-（OH）D3及PINP水平。

1.4.2 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察小鼠胰島病理學變化將4%多聚甲醛固定的胰腺組織進行常規石蠟包埋，切片，HE染色，并在光學顯微鏡下觀察胰島病理學改變。

1.4.3 TUNEL法觀察小鼠胰島細胞凋亡情況具體操作步驟按TUNEL試劑盒說明書進行。依次將胰腺組織石蠟切片放入二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-無水乙醇Ⅰ5 min-無水乙醇Ⅱ5 min-85%酒精5 min-75%酒精5 min-蒸餾水洗。滴加蛋白酶K工作液，37℃溫箱孵育20 min，PBS洗滌3次。加破膜工作液，常溫孵育20 min，PBS洗滌3次。放入3%雙氧水溶液中室溫避光孵育20 min，PBS洗滌3次。滴加buffer常溫孵育10 min，去掉平衡液。Recombinant TdT Enzyme∶Biotin-dUTP Labeling Mix∶Equilibration Buffer=1 μL∶5 μL∶50 μL比例混合加入，濕盒內37℃溫箱孵育1 h，PBS洗滌3次。Streptavidin-HRP和TBST按 照1∶200比 例 混 合 加入，濕盒內37℃溫箱孵育30 min，PBS洗滌3次。滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，純水沖洗切片終止顯色。蘇木素復染1 min，純水洗滌，分化液分化數秒，純水洗滌，氨水返藍，純水沖洗。無水乙醇脫水，隨后正丁醇浸泡5 min，放入二甲苯中進行透明后晾干，中性樹膠封片。蘇木素染細胞核呈藍色，DAB顯現出來的陽性凋亡細胞核呈棕黃色。

1.4.4 免疫組織化學法觀察小鼠胰腺凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3陽性表達情況取胰腺組織石蠟切片，脫蠟和水化，抗原修復，消除內源性過氧化物酶活性，封閉。一抗Bax、Bcl-2、Caspase-3 37℃孵育60~120 min，二抗37℃孵育0.5~2 h，DAB顯色。蘇木素復染、脫水、透明和封片，拍照。用ImageJ軟件分析Bax、Bcl-2、Caspase-3陽性面積百分比。Bax、Bcl-2在細胞漿表達，Caspase-3在細胞漿和細胞核均有表達，呈棕黃色或棕褐色顆粒。

1.5 統計方法采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，若方差不齊，則采用Kruskal-Wallis檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠血清空腹血糖及空腹胰島素水平比較表1結果顯示，經過補腎健脾方干預后，治療組小鼠空腹血糖值和胰島素水平均低于陽性對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。

表1 各組小鼠血清空腹血糖及空腹胰島素水平比較Table 1 Comparison of mouse serum fasting blood glucose and fasting insulin levels among various groups （±s）

表1 各組小鼠血清空腹血糖及空腹胰島素水平比較Table 1 Comparison of mouse serum fasting blood glucose and fasting insulin levels among various groups （±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，與陰性對照組1比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與陰性對照組2比較；⑤P＜0.01，與陽性對照組比較

組別陰性對照組1陰性對照組2陽性對照組治療組鼠數/只4 4 8 8空腹血糖/（mmol·L-1）6.90±0.66 7.90±0.51 11.73±1.40②④9.00±1.14②⑤空腹胰島素/（mU·L-1）5.02±0.23 5.13±0.77 8.12±0.97②④6.35±0.97①③⑤

2.2 各組小鼠血清APN、25-（OH）D3、PINP水平比較表2結果顯示：經補腎健脾方干預后，治療組小鼠APN、25-（OH）D3、PINP水平較陽性對照組明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；治療組25-（OH）D3水平較陰性對照組2明顯升高（P＜0.05），陰性對照組2的APN水平較陰性對照組1明顯降低（P＜0.05）。

表2 各組小鼠血清脂聯素（APN）、25-羥基維生素D3[25-（OH）D3]、Ⅰ型前膠原氨基端原肽（PINP）水平比較Table 2 Comparison of mouse serum adiponectin（APN），25-hydroxyvitamin D3[25-（OH）D3]and precollagen type I aminoterminal propeptide（PINP）levels among various groups （±s）

表2 各組小鼠血清脂聯素（APN）、25-羥基維生素D3[25-（OH）D3]、Ⅰ型前膠原氨基端原肽（PINP）水平比較Table 2 Comparison of mouse serum adiponectin（APN），25-hydroxyvitamin D3[25-（OH）D3]and precollagen type I aminoterminal propeptide（PINP）levels among various groups （±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，與陰性對照組1比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與陰性對照組2比較；⑤P＜0.01，與陽性對照組比較

組別陰性對照組1陰性對照組2陽性對照組治療組鼠數/只4 4 8 8 APN/（pg·mL-1）116.93±5.94 93.71±4.53①100.86±10.23 123.63±18.02②⑤25-（OH）D3/（ng·mL-1）8.25±1.95 6.78±0.44 6.55±1.65 9.43±0.90③⑤PINP/（μg·mL-1）365.69±49.08 329.26±36.20 249.65±18.51②④306.33±19.92②⑤

2.3 各組小鼠胰島病理形態比較圖1結果顯示：陰性對照組小鼠胰島細胞結構清晰，數量較多；陽性對照組小鼠胰島細胞結構受到明顯破壞，數量明顯減少；經補腎健脾方干預后，治療組小鼠胰島細胞無論是結構還是數量，與陽性對照組相比較，均得到明顯改善。

圖1 各組小鼠胰島病理形態比較（HE染色，×100）Figure 1 Comparison of the histopathological morphology of the mouse pancreas isletamong various groups（by HE staining，×100）

2.4 各組小鼠胰島細胞凋亡比較圖2結果顯示：陰性對照組小鼠胰島細胞未見明顯變化，陽性對照組小鼠胰島細胞凋亡明顯，治療組小鼠胰島細胞雖然可見細胞凋亡，但與陽性對照組相比較，其凋亡細胞明顯減少。表3結果顯示：與陽性對照組比較，治療組小鼠胰腺TUNEL染色面積百分比降低（P＜0.01）。表明補腎健脾方可抑制胰島細胞凋亡。

表3 各組小鼠胰島TUNEL染色面積百分比比較Table 3 Comparison of the percentage of TUNELstained area of mouse pancreas islets among various groups（±s）

表3 各組小鼠胰島TUNEL染色面積百分比比較Table 3 Comparison of the percentage of TUNELstained area of mouse pancreas islets among various groups（±s）

①P＜0.01，與陽性對照組比較

組別陰性對照組1陰性對照組2陽性對照組治療組鼠數/只4 4 8 8 TUNEL染色陽性面積/%8.32±1.02 6.81±2.73 17.15±5.54 7.68±3.75①

圖2 各組小鼠胰島TUNEL染色結果（×100）Figure 2 TUNEL staining results of the pancreasislets of various groups of mice（×100）

2.5 各組小鼠胰腺Bax、Bcl-2、Caspase-3陽性面積百分比比較表4、圖3~圖5結果顯示：與陽性對照組，治療組db/db小鼠胰腺Bax、Caspase-3陽性面積百分比降低（P＜0.05或P＜0.01），Bcl-2陽性面積百分比升高（P＜0.01）。表明補腎健脾方可增強凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達，抑制促凋亡蛋白Bax和凋亡執行蛋白Caspase-3的表達，保護胰島細胞。

圖5 各組小鼠胰腺Bcl-2免疫組織化學結果（×100）Figure 5 Immunohistochemical results of Bcl-2 in the pancreas of various groups of mice（×100）

表4 各組小鼠胰腺Bax、Bcl-2、Caspase-3陽性面積百分比比較Table 4 Comparison of the percentage of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 positive area in mouse pancreas among various groups（±s）

表4 各組小鼠胰腺Bax、Bcl-2、Caspase-3陽性面積百分比比較Table 4 Comparison of the percentage of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 positive area in mouse pancreas among various groups（±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，與陽性對照組比較

組別陰性對照組1陰性對照組2陽性對照組治療組鼠數/只4 4 8 8 Bax/%46.34±3.83 45.24±2.75 51.42±4.07 40.21±3.96②Bcl-2/%53.75±3.97 56.88±5.98 42.73±4.84 58.89±9.62②Caspase-3/%44.04±10.86 40.39±3.59 52.13±6.03 40.70±4.59①

圖3 各組小鼠胰腺Caspase-3免疫組織化學結果Figure 3 Immunohistochemical results of Caspase-3 in the pancreas of various groups of mice（×100）

圖4 各組小鼠胰腺Bax免疫組織化學結果（×100）Figure 4 Immunohistochemical results of Bax in the pancreas of various groups of mice（×100）

3 討論

2型糖尿病合并骨質疏松歸屬于中醫學“消渴骨痿”的范疇[7]，脾腎二臟是該病的主要病位。《黃帝內經·素問篇》指出“腎生骨髓”“腎主骨”，即骨骼的生長發育與腎密切相關。一方面，糖尿病患者脾氣虧虛，運化水谷功能出現障礙，影響水谷精微的消化，致使吸收不足[8]；另一方面，腎藏精，精生髓，髓生骨，水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不能任身，發為骨痿[9]。因此，從發病機制上，“消渴骨痿”是“消渴”的進一步發展，可視為消渴病變之一。因此，其治法仍可遵循課題組前期應用補腎健脾法治療糖尿病的原則，使用補腎健脾方來進行治療。

胰島細胞功能決定胰島素的分泌水平，胰島素除了能夠降低血糖，還與骨代謝相關。研究[10]表明：成骨細胞表面存在胰島素受體，胰島素通過這些受體，發揮促進骨形成的作用；胰島素受體也存在于破骨細胞表面，胰島素與破骨細胞表面胰島素受體結合，抑制破骨細胞活性，從而抑制骨吸收。可見，胰島細胞功能與糖-骨代謝關系密切。本研究中，HE染色結果顯示，陽性對照組小鼠胰島細胞結構受到破壞，TUNEL染色結果也可見陽性對照組小鼠胰島細胞更容易被染色，表明補腎健脾方對小鼠胰島細胞具有保護作用。Bax具有促凋亡作用，本研究發現，Bax表達在陽性對照組顯著增強，在治療組受到明顯抑制且水平與陰性對照組非糖尿病小鼠相當；Bcl-2有抑制凋亡作用，其表達在陽性對照組小鼠胰島細胞被明顯抑制，在治療組中顯著增強；Caspase-3的表達在陽性對照組增強，在治療組中明顯受到抑制。以上凋亡相關蛋白表達結果提示補腎健脾方對db/db小鼠胰島細胞凋亡有抑制作用，胰島細胞凋亡程度直接決定小鼠胰島素分泌水平，而胰島素又在糖代謝及骨代謝過程中均發揮作用，并能夠影響其代謝指標。

脂聯素（APN）由脂肪細胞分泌，可增強胰島素敏感性[11]，同時對骨骼肌代謝具有保護作用[12]。APN通過影響成骨細胞和破骨細胞活性調節骨代謝[13-15]。Oshima等[16]發現，APN可以抑制破骨細胞的分化，亦可促進成骨細胞的增殖與活性，促進骨生成，增加骨密度。可見，APN對于糖代謝及骨代謝均有調節作用。Ⅰ型前膠原氨基端原肽（PINP）由成骨細胞分泌，其升高提示I型膠原的合成速率加快，骨形成活躍[17]。25-羥基維生素D3[25-（OH）D3]缺乏是導致骨質疏松癥發生的重要原因，維持充足的25-（OH）D3是骨骼健康的必要條件[18]。APN、25-（OH）D3、PINP均是反映骨代謝變化的指標，其中APN又與糖代謝密切相關。本研究還發現，對于db/db陽性小鼠和BKS背景陰性小鼠，給予補腎健脾方干預后，其血清APN水平均高于生理鹽水灌胃組，提示無論小鼠血糖水平如何，補腎健脾方均能升高其血清APN水平。陽性對照組和治療組2組db/db小鼠PINP水平均低于陰性對照組，提示高糖環境下，PINP水平受抑制，給予補腎健脾方灌胃后，治療組小鼠PINP水平顯著高于陽性對照組，表明補腎健脾方能夠調節db/db小鼠PINP水平。在本研究中，治療組25-（OH）D3水平能維持較高水平，且顯著高于陽性對照組，提示補腎健脾方可以直接調節糖-骨代謝相關指標。

綜上所述，補腎健脾方可改善db/db小鼠糖代謝及骨代謝指標，其可能的機制有兩點：一是通過抑制胰島細胞凋亡、改善胰島素分泌水平實現的；二是直接調節糖-骨代謝指標。補腎健脾方對以上指標的影響，可能是其在臨床上降低患者血糖，提高患者骨密度的作用機制之一。