龍膽苦苷對CCl4 誘導的肝纖維化模型大鼠保護作用及機制研究

黃燕，余淑貞，于小華，黎忠良，饒品德，曹娟，湯小林

（江西省兒童醫院，南昌 330006）

肝纖維化是由慢性非自限性肝損傷產生的一種以細胞外基質過量沉積為特征的損傷修復反應[1]。過度纖維化可導致肝硬化、肝癌的發生，預防或及時逆轉肝纖維化進展是保護肝臟的重要策略[2-3]。中醫理論認為肝臟多“陽常有余陰常不足”，肝病機理多屬“體陰而陰不足”，治療方面，傳統中醫藥在抗肝纖維化方面展示了其獨特優勢[4-5]。

龍膽草是傳統醫學治療肝臟疾病的常用藥物，性寒，具瀉肝膽實火、清熱除燥等功效[4]。其主要活性成分龍膽苦苷是一種活性較強的裂環烯醚萜類物質[5]。據報道龍膽苦苷具有逆轉肝損傷、治療酒精性肝炎及肝內膽汁淤積等藥理活性，但藥理機制尚未明確，多認為與抑制炎癥、抗氧化等有關[6-8]?；诖耍狙芯繑M構建肝纖維化大鼠模型，探討龍膽苦苷對肝功能、肝纖維化的保護作用及其機制，為龍膽苦苷的進一步應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 清潔級SD 大鼠，雄性，180 g～220 g，購自南昌大學動物實驗中心。龍膽苦苷(含量＞95%) 購自南京道斯夫生物科技公司，批號：181116A。四氯化碳（99%）購自國藥集團化學試劑公司。丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）及丙二醛（MDA）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；轉化生長因子-β(TGF-β)、透明質酸（HA）及膠原蛋白-III（COL III）檢測試劑盒購自武漢博士德生物公司；谷氨酰轉肽酶(GGT)、羥脯氨酸（Hyp）、超氧化物歧化酶（SOD）均購自Sigma 公司。

1.2 主要儀器 7020 型全自動生化分析儀（日本日立）、BT125D 電子分析天平（德國賽多利斯）、CX-31 光學顯微鏡（日本OLYMPUS）、UV-2550 紫外分光光度計（日本島津）、FSH-2A 高速組織勻漿機（華城潤華）、低溫高速離心機(美國賽默飛)。

1.3 實驗分組及處理 選取60 只SD 大鼠，適應性飼養一周，隨機均分為對照組、模型組、干預組，各20 只。模型組大鼠每隔一天腹腔注射15% CCL4的油溶液（劑量：0.80 mL/kg），首劑量加倍。干預組大鼠腹腔注射CCL4的油溶液后，給予灌胃服用60 mg/kg 劑量龍膽苦苷。對照組大鼠給予等劑量PBS腹腔注射。三組大鼠分組處理8 周，常規飼養。

1.4 觀察指標

1.4.1 肝組織外觀觀察 實驗大鼠處死后，迅速剖腹，將完整的肝臟取出后仔細觀察，主要包括肝臟外觀形態、色澤變化、組織彈性，及是否出現明顯病變等。

1.4.2 血清中AST、ALT、ALB、GGT 含量測定 分組處理后大鼠心臟穿刺取血3 mL，離心后取血清，使用全自動生化分析儀分析血清中ALT、AST、ALB、GGT 含量，具體操作依據設備使用說明。

1.4.3 血清中TGF-β1、HA、COL III 含量測定 取大鼠血清，依據TGF-β1、HA、COL III 檢測試劑盒步驟處理樣本，于450 nm 波長處測定吸光度，換算得到TGF-β1、HA 及COL III 值。

1.4.4 肝組織勻漿MDA、SOD 和Hyp 含量測定大鼠分組處理后取定量肝右葉組織，置生理鹽水中漂洗干凈，精密吸取3 mL 低滲鹽水（濃度：0.86%）加入燒杯，快速將肝右葉組織剪碎，使用高速組織勻漿機勻漿，用低溫離心機離心處理分離上清液，按照試劑盒步驟處理樣品，于特定波長處進行測定，計算肝組織勻漿中MDA、SOD 和Hyp含量。

1.5 統計方法 用SPSS 22.0 統計學軟件處理數據，計量資料以()表示，組間比較用t 檢驗，P＜0.05 表示有顯著性差異。

2 結果

2.1 大鼠肝組織形態觀察 觀察各組大鼠肝組織形態，對照組大鼠肝組織呈均勻暗紅色，表面有光澤，形態正常，組織富有彈性。模型組大鼠肝組織呈灰黃色，顏色不均勻，欠光滑，且有局部白色斑塊，偏硬。干預組大鼠肝組織顏色不均，整體呈現紅色，色澤和彈性均好于模型組，但較干預組仍較差。

2.2 大鼠肝功能指標情況 比較各組大鼠分組處理后肝功能指標情況，模型組和干預組大鼠血清AST、ALT、ALP、GGT 均明顯高于對照組（P 均＜0.05）；干預組大鼠血清AST、ALT、ALP、GGT 均明顯低于模型組（P 均＜0.05），見表1。

表1 大鼠血清肝功能指標比較()

表1 大鼠血清肝功能指標比較()

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2.3 大鼠肝纖維化指標情況 比較大鼠分組處理后血清肝纖維化指標水平，模型組和干預組大鼠血清TGF-β1、HA、COL III 均明顯高于對照組（P均＜0.05）；干預組大鼠血清TGF-β1、HA、COL III均明顯低于模型組（P 均＜0.05），見表2。

表2 大鼠血清肝纖維化指標比較()

表2 大鼠血清肝纖維化指標比較()

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2.4 大鼠肝氧化應激指標情況 比較大鼠分組處理后肝組織勻漿氧化應激指標水平，模型組和干預組大鼠MDA 和Hyp 均高于對照組，SOD 低于對照組（P 均＜0.05）。干預組大鼠MDA 和Hyp 均低于模型組，SOD 高于模型組（P 均＜0.05），見表3。

表3 大鼠肝組織勻漿氧化應激指標比較()

表3 大鼠肝組織勻漿氧化應激指標比較()

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

3 討論

肝纖維化是組織損傷的自我修復反應，也是多種慢性肝病的重要病理特征和進展過程[9]。早期肝纖維化是可逆的，也是預防慢性肝病進展為肝硬化的關鍵策略，中醫則以氣虛和血瘀的證候表現為辨證要點[10]。龍膽草歸肝、膽經，具有瀉肝膽火、清熱燥濕作用，也是多種肝膽方劑的主藥。多研究表明其主要成分龍膽苦苷具有逆轉肝損傷、治療肝炎作用，但作用機制有待明確[11]。

本研究經CCL4誘導構建大鼠肝纖維化模型，肝組織觀察可見明顯異常，提示已發生病理病變；血清肝功能指標AST、ALT、ALP、GGT均明顯增高，表明CCL4會明顯影響肝功能。AST 多在肝細胞線粒體內分布、ALT 主要存在于肝細胞漿中，當肝細胞受損或壞死時，AST、ALT、ALP、GGT 的含量可靈敏反映肝細胞受損情況[12-13]。給予龍膽苦苷則可以明顯緩解CCL4誘導的肝組織病變及血清指標變化，提示具有抗肝功能損傷作用。

肝細胞受損時細胞外基質中膠原代謝異常、纖維結締組織增生并形成了纖維化[14]。本研究大鼠經CCL4誘導血清TGF-β1、HA、COL III 水平均顯著提高，表明發生肝纖維化病變。TGF-β1 是肝纖維化關鍵細胞因子，可經多途徑刺激肝星狀細胞活化促進肝纖維化；HA 可反映肝內生成纖維量及受損情況；COL III 水則是纖維化重要基質[15-16]。因此TGF-β1、HA、COL III 水平可反應肝纖維化進展情況。研究顯示龍膽苦苷可明顯抑制TGF-β1、HA、COL III 的升高，表明可明顯緩解CCL4誘導引起的肝纖維化水平。

肝纖維化的誘發及影響因素復雜，高水平的氧化應激在肝纖維化進展中有重要作用，可刺激成纖維細胞和肝星狀細胞，促進膠原的合成及沉積，加速肝纖維化的進程；因此抗氧化損傷是逆轉肝纖維化的一個研究熱點[17]。研究表明，龍膽苦苷具有一定抗氧化應激活性，可降低膿毒血癥模型小鼠肝組織一氧化氮水平，并誘導髓過氧化物酶活性發揮護肝作用[18]。在爆發性肝損傷模型小鼠中也可緩解谷胱甘肽含量的降低，并改善過氧化水平[19]。本研究中，龍膽苦苷可明顯緩解CCL4誘導引起的肝組織MDA 和Hyp 水平增高，及SOD 的降低，表明龍膽苦苷具有明顯的抗氧化應激作用。這與已有研究一致，可能是保護肝功能、抗纖維化活性的一個重要機理。

綜上，本研究明確龍膽苦苷具有肝保護作用，能抑制肝纖維化進展，可能與抗氧化應激損傷有關，明確機制有待進一步研究。