NNMT在大腸腺癌與大腸腺瘤的表達對比及對大腸腺癌短期生存的影響＊

王超 陳見蘇 劉蘭仔

當前研究認為，腫瘤的發(fā)生發(fā)展屬于一個較為復雜的過程與階段，實際是由各類腫瘤相關基因表達失常或諸多腫瘤抑制基因失活引起，因此，在臨床工作中若需要了解整個腫瘤癌變過程中的基因表現以及基因動態(tài)改變，則需要研究整個基因組在癌癥進展過程中的改變及其所帶來的基因表達動態(tài)變化[1-2]。在既往的臨床工作中，采用了基因芯片對腎癌及其癌旁組織進行了相應的大規(guī)模基因篩查試驗及相關研究，發(fā)現煙酰胺N-甲基轉移酶（NNMT）在腎癌等組織中呈現出較高的表達水平，且其表達水平明顯高于周圍正常組織[3]。同時有研究對NNMT在各類消化系統(tǒng)癌癥疾病中的研究進行分析發(fā)現，NNMT在諸多腫瘤組織中也呈現出異常升高的改變水平，且與癌旁組織相比明顯升高[4]。本研究就NNMT在大腸腺癌與大腸腺瘤的表達及大腸腺癌的預后進行分析，旨在為疾病的治療及預后判斷提供可靠依據，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年2月-2019年2月福建省立醫(yī)院南院外科手術或內鏡下取材的正常大腸黏膜、大腸腺瘤及大腸腺癌各50例。納入標準：患者因疑似大腸病變來院接受檢查；生命體征平穩(wěn)，認知功能正常；具有完整的臨床資料。排除標準：合并其他類型的腫瘤性疾病、消化系統(tǒng)疾病；對本研究試驗不耐受或持反對態(tài)度。正常大腸黏膜組，男28例，女22例；年齡20～72歲，平均（56.25±4.12）歲。大腸腺瘤組，男27例，女23例；年齡22～73歲，平均（56.80±4.02）歲。大腸腺癌組，男26例，女24例；年齡23～70歲，平均（56.10±4.92）歲。三組一般資料相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本次試驗符合醫(yī)學倫理會審核批準，患者知情同意本次試驗。

1.2 方法

采用S-P免疫組化技術對NNMT進行檢測，方法：將正常大腸黏膜、大腸腺瘤及大腸腺癌組織留取部分標本放入福爾馬林溶液中，將其送病理檢查由此進一步對病理類型進行判斷，將其余剩下的組織修剪成大小為 0.2 cm×0.2 cm×0.5 cm 的組織塊，使用生理鹽水對其反復沖洗3次以盡可能地去除殘留的糞質及血凝塊，分塊后放入EP管內轉入液氮罐中保存?zhèn)溆肹5]。PT-PCR對各標本中NNMT mRNA的表達情況進行測量，首先利用Trizol法對組織中的總RNA進行提取，隨后應用紫外分光光度計法對定量RNA進行測量。按照逆轉錄試劑盒的說明對cDNA進行合成，并進行逆轉錄反應，在37 ℃的環(huán)境中進行15 min的反應，隨后進行逆轉錄酶的失活反應，反應需要在5 ℃環(huán)境中進行5 s。從基因GeneBank中查找出相關的引物序列進行RT-PRC反應，反應條件為：95 ℃環(huán)境中進行預變形10 s，1 Cycle，PCR 反應為 95 ℃，5 s，85 ℃，反應 20 s，40 Cycle，融解曲線為 55 ℃，80 Cycle。PCR 產物的定性條件：取PCR的產物2 μl放置在2.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，之后采用全自動凝膠成分分析系統(tǒng)對其拍照，將NNMT/β-actin比值×100作為NNMT mRNA的相對表達量。Westem-blot對上述各個標本中的NNMT蛋白的表達情況進行檢測，具體操作：將組織剪碎后，向其加入細胞裂解液對其充分裂解，該裂解操作需要在冰上操作進行；隨后進行離心處理，離心速度為12 000 r/min，共離心15 min，提取血清后轉移到新管中，采用BCA法對NNMT蛋白含量進行測量[6]。使用40 μg的蛋白質作為上樣量，常規(guī)SDS聚丙烯酰胺凝膠實施封閉處理。將人NNMT多克隆抗體，小鼠抗人β-actin抗體作為一抗，將山羊抗兔IgG及山羊抗小鼠作為二抗。ECL發(fā)光，X線膠片感光，將自動洗片機進行洗片，檢測NNMT蛋白的表達水平，采用全自動凝膠成像系統(tǒng)測定各個組別的蛋白電泳積分光度值，NNMT/β-actin比值代表NNMT蛋白相對表白量[7]。

1.3 觀察指標

對比NNMT mRNA及其蛋白在正常大腸黏膜組、大腸腺瘤組及大腸腺癌組組織中相對表達量，分析NNMT表達與大腸腺癌臨床病理因素的關系，對比不同NNMT表達情況下大腸腺癌患者短期生存率。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件對所得數據進行統(tǒng)計分析，計量資料用（±s）表示，多組比較采用方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NNMT mRNA及其蛋白在各個組織中相對表達量對比

三組NNMT mRNA及其蛋白表達量相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；大腸腺瘤組、大腸腺癌組NNMT mRNA及其蛋白表達量均高于正常大腸黏膜組，大腸腺癌組NNMT mRNA及其蛋白表達量均高于大腸腺瘤組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 NNMT mRNA及其蛋白在各個組織中相對表達量對比（±s）

表1 NNMT mRNA及其蛋白在各個組織中相對表達量對比（±s）

*與正常大腸黏膜組比較，P＜0.05；#與大腸腺瘤組比較，P＜0.05。

組別 NNMT mRNA NNMT 蛋白正常大腸黏膜組（n=50） 9.33±0.25 0.41±0.08大腸腺瘤組（n=50） 115.36±20.69* 0.65±0.06*大腸腺癌組（n=50） 992.25±84.25*# 0.89±0.05*#F值 12.254 10.987 P值 0.000 0.000

2.2 NNMT表達與大腸腺癌臨床病理因素的關系

不同NNMT表達情況大腸癌患者的淋巴結轉移情況、Dukes分期、組織學類型及浸潤深度比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同NNMT表達情況大腸癌患者的組織學分級比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表 2。

表2 NNMT表達與大腸腺癌臨床病理因素的關系（例）

2.3 不同NNMT表達情況大腸腺癌患者短期生存期對比

大腸腺癌患者均接受為期3年的隨訪，NNMT陽性表達患者3年生存率為50.00%（14/28），低于NNMT陰性表達患者的90.91%（20/22），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9.475，P=0.002）。

3 討論

大腸腺癌作為臨床上一類較為常見的惡性腫瘤性疾病，近年來隨著社會的不斷發(fā)展，誘發(fā)因素的不斷增多，發(fā)病率也呈現不斷升高的趨勢，同時據報道顯示，超過80%的大腸腺癌患者多由腺瘤性息肉不斷惡變及進展而來[8]。也有臨床資料顯示，腫瘤的發(fā)生發(fā)展屬于一個比較復雜且變化較快的過程，實際上是由多種腫瘤的相關基因表達或抑癌基因失去活性所致[9]。因此，采取科學有效的指標評價大腸腺瘤的發(fā)生發(fā)展及對大腸腺癌病情的影響具有重要的臨床意義。尋找并探討克隆相關基因是一個世界范圍的重要課題。既往臨床資料顯示，NNMT最早在1994年于肝臟組織內發(fā)現的一種新型物質，被證實與肝癌細胞的克隆與復制具有密切的相關性，隨后發(fā)現其基因位于11號染色體的短臂，其由三個外顯子及兩個內含子構成，因此所編碼的mRNA分子長度為952個核苷酸，分子量為29.6 KD[10-11]。在既往報道中發(fā)現，NNMT與各類疾病間均具有密切的關系，不過這些研究進行的帕金森與NNMT的分析相對較多。近年來，隨著對大腸腺癌研究的不斷深入，發(fā)現NNMT與癌癥的發(fā)生發(fā)展具有密切的相關性，同時發(fā)現NNMT在甲狀腺癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，不過關于NNMT與甲狀腺癌發(fā)病機制之間相關研究仍然較少[12]。隨后有研究開始就NNMT在大腸腺癌中的表達水平進行分析，發(fā)現NNMT多在大腸腺癌的患者中以分泌型的形式存在，也被認為是大腸腺癌的一種血清標志物，但具體發(fā)病機制也仍值得分析與探討[13]。

在本次研究中，就NNMT在大腸腺瘤和大腸癌中的表達及與大腸腺癌的預后分析，結果顯示，三組NNMT mRNA及其蛋白表達量相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；大腸腺瘤組、大腸腺癌組NNMT mRNA及其蛋白表達量均高于正常大腸黏膜組，大腸腺癌組NNMT mRNA及其蛋白表達量均高于大腸腺瘤組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。NNMT mRNA在大腸腺癌患者中會表現出較高的表達水平，結果顯示隨著大腸黏膜上皮細胞損害，腺瘤向著腺癌的進展過程中也會開始出現NNMT表達水平升高的情況，由此也進一步說明了NNMT的高表達會在腺瘤性息肉中存在，這也證實了NNMT的高表達可能是導致大腸腺癌發(fā)生發(fā)展的一個重要的機制，也可被認為是導致腺瘤向著腺癌轉化的作用，與既往研究報道基本一致[14]。同時，本研究就NNMT表達與大腸腺癌臨床病理因素的關系進行分析，不同NNMT表達情況大腸癌患者的組織學分級情況比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。大腸腺癌組織分級越低，細胞凋亡調控機制障礙程度較高，癌細胞增殖情況越強，病情越重，NNMT表達水平就越高，患者的預后表現也就越差[15]。另外，大腸腺癌患者均接受了為期3年的隨訪，NNMT陽性表達患者3年生存率為50.00%（14/28），低于NNMT陰性表達患者的90.91%（20/22），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結果可見，NNMT陽性表達患者的預后情況相對較差，證實了上述研究。不過由于本次研究樣本量較少，隨訪時間有限，在收集數據上可能存在缺陷，在接下來的研究中可深入分析。

綜上所述，NNMT在大腸腺瘤與大腸腺癌組織中的表達存在明顯的差異性，NNMT陽性表達患者的短期生存率較低。