HPV E6/E7 mRNA 及病毒載量檢測對ASCUS 患者分層及疾病進展的預測價值

白 萍 李巧云

鄭州大學第五附屬醫院婦科，河南鄭州 450000

目前，宮頸癌位居女性因癌癥死亡的第4 位。在我國，宮頸癌已成為威脅女性健康的第二大惡性腫瘤，具有發病年齡年輕化且發病率逐步上升的特點。宮頸液基薄層細胞（thinprep cytologic，TCT）檢測是篩查宮頸癌及高級別病變的主要方法，其中，對于非典型鱗狀細胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASCUS）的診治目前仍然存在爭議。ASCUS 患者的細胞學特征為雖存在鱗狀上皮的異常，但診斷為上皮內病變的證據不足，因此，其組織病理學的差異很大。目前主要是根據人乳頭瘤病毒（human papillionma virus，HPV）DNA 的結果進行ASCUS 患者的分流，由于HPV DNA 存在假陽性率高及特異性低等問題，使得該類患者的陰道鏡轉診率及活檢率居高不下，造成了過度治療，增加了患者的經濟和心理負擔。E6 基因通過掌握細胞周期位點，允許病毒DNA 進行非循環復制；E7 基因主要是掌控細胞周期G1、S 期，在病毒擴增階段，病毒拷貝數擴增，E6 及E7 基因表達的mRNA 可以被有效檢測出來。因此，HPV E6/E7 mRNA 有望成為目前最有希望的宮頸癌標志物。本研究選取了198例經TCT 篩查結果為ASCUS 患者，對其高危型HPV感染情況、HPV E6/E7 mRNA 檢測及宮頸病變分級情況進行統計及分析，旨在探討HPVE6/ E7mRNA對ASCUS 患者的分流及疾病進展的預測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020 年3 月至2022 年3 月就診于鄭州大學第五附屬醫院婦科門診經TCT 檢驗結果為ASCUS 患者 198 例，病理診斷醫師依據國際 TBS（the Bethesda）分類標準做出診斷。年齡19～63 歲，平均（38.9±7.2）歲。納入標準：①在鄭州大學第五附屬醫院經TCT 檢查初次發現為ASCUS；②性接觸史≥3 年且目前未妊娠及哺乳期女性；③檢查前24h內無性生活史、72h 內無陰道灌洗上藥史；④無宮頸相關操作及治療史，無其他惡性疾病及放化療病史。本研究通過醫院倫理委員會批準（倫理審批號：Y2021014），且所有患者均知曉宮頸癌篩查方法且簽署相關知情同意后行陰道鏡及活檢。對其中活檢病理為高度鱗狀上皮內病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）的患者統計HPV DNA 及HPV E6/E7 mRNA 這2 種檢測方法對HSIL+的檢出率、診斷效能及ROC 曲線的曲線下面積（area under the curve，AUC）值并進行分析；對于活檢病理為HSIL-且未行相關治療的95例患者隨訪1年，行ROC曲線分析2 種檢測方法對疾病進展的預測效能。

1.2 方法

1.2.1 宮頸脫落細胞采集與讀片 ①TCT：按照TCT使用說明書收集宮頸脫落細胞，標本采集后放入細胞保存液（寧波美生醫療器械有限公司），由醫院兩位病理科醫師在顯微鏡下按照TBS 標準報告結果。②高危HPV DNA 檢測：采用杭州鉆柏科技有限公司生產的HPV DNA 市場檢測試劑盒檢測14 種高危型別（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66 和68），含有任一種陽性即視為陽性。③HPV E6/E7 mRNA 檢查：采用河南中美合資科蒂亞生物技術有限公司生產的E6/E7mRNA 試劑（支鏈DNA 信號擴增法），使用科蒂亞公司自產的HS 冷光儀進行檢測。檢測結果為拷貝數，≥1copy/ml為陽性。

1.2.2 陰道鏡檢查與宮頸活檢 使用電子陰道鏡系統，患者常規消毒鋪巾，充分暴露宮頸，生理鹽水清理宮頸表面多余的分泌物，將3%醋酸溶液涂抹宮頸表面，準確記錄時間，觀察宮頸上皮組織變化，再將濃碘涂抹于宮頸上觀察著色情況，于所有可疑病變部位取樣活檢。對陰道鏡鏡下未見明顯異常者，則進行常規四點活檢或者行宮頸管搔刮。所取標本均由醫院專業的病理科醫師完成標本的制片及診斷，若結果不一致則由兩位高年資醫師重新閱片，必要時行相應免疫組織化學染色輔助診斷。

1.2.3 隨訪 根據2020 年美國陰道鏡和子宮頸病理學會發布的2019 版基于風險的子宮頸癌篩查異常及癌前病變管理共識指南，進行分層處理：活檢HSIL+者立即行相對應治療；活檢病理HSIL-者，1年后行TCT 及高危型HPV 檢測，上述檢測結果任何一項異常則行陰道鏡檢查及病理活檢。

1.3 統計字方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件對數據進行處理分析。計數資料采用例數（百分率）[（%）]表示，組間比較采用檢驗。對HPV E6/E7 mRNA 拷貝數進行正態性檢驗，不符合正態分布采用[（，）]表示。相關性分析采用Spearman。使用ROC 曲線下面積（area under the curve，AUC）對HPV E6/E7 mRNA 及HPV DNA 檢查的診斷效能，以及預測效能進行描述與分析。＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸活檢病理情況

納入此次研究的198 例ASCUS 患者中，正常/慢性炎性反應117 例（59.10%）、低級別鱗狀上皮內病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）39 例（19.70%）、HSIL 40 例（20.20%）、宮頸癌2例（1.01%）。其中，HPV DNA 陽性者144 例，HPV E6/E7 mRNA 陽性者120 例。符合1 年后隨訪條件（病理活檢HSIL-）的156 例，其中失訪61 例，TCT 結果正常且HPV 陰性者69 例，TCT 異常或高危型HPV陽性者26 例，行陰道鏡及活檢結果顯示：慢性炎性反應17 例，LSIL6 例，HSIL3 例。

2.2 不同方法檢測宮頸病變及HSIL+的診斷效能

HPV DNA對正常/慢性炎性反應及LSIL的陽性檢出率優于HPV E6/E7 mRNA，差異有統計學意義（＜0.05）；HPV DNA 及HPV E6/E7 mRNA 對HSIL+的檢出率，差異無統計學意義（＞0.05），見表1。

表1 2 種檢測方法對各個級別宮頸病變檢出率比較

宮頸活檢病理HSIL+患者為42 例，HPV DNA 檢查的特異性低于HPV E6/E7 mRNA，使用McNemar檢驗可見二者差異有統計學意義（＜0.05）；HPV DNA檢查的敏感度與HPV E6/E7 mRNA差異無統計學意義（＞0.05），見表2。

表2 2 種檢測方法對HSIL+的診斷效能比較

2.3 各級別宮頸病變患者的HPV E6/E7 mRNA 及病毒載量比較

各級別宮頸病變患者的HPV E6/E7 mRNA 的拷貝值經Spearman 秩相關分析，發現隨著宮頸病變級別的進展，HPV E6/E7 mRNA 的陽性率及拷貝值與之呈正相關（=1.0，0.791，＜0.05），且各病變級別差異有統計學意義，見表3。

表3 各個級別宮頸病變患者的HPV E6/E7 mRNA 的病毒載量比較

2.4 ROC 曲線分析

2 種檢測方法對HSIL+的診斷效能行ROC 曲線分析，并計算AUC，發現HPV E6/E7 mRNA 拷貝值的AUC 值為0.941，分別大于HPV E6/E7 mRNA 定性的AUC 值0.735 及HPV DNA 的AUC 值0.613，診斷效能最高，具體詳見圖1、2。

圖1 病毒載量的ROC 曲線

圖2 HPV E6/E7 mRNA 及HPV DNA 定性ROC 曲線

2.5 隨訪1 年后疾病進展情況

1 年后進展為HSIL 患者3 位（2 位由LSIL 進展，1 位由炎性反應進展），ROC 曲線分析初次HPV DNA 檢測及HPV E6/E7 mRNA 檢測對1 年后病變進展的預測，發現HPV E6/E7 mRNA 的AUC 值為0.783，大于HPV DNA 的AUC 值0.658，見圖3。

圖3 1 年后隨訪ROC 曲線

3 討論

ASCUS 的細胞學特點為細胞的異型性并不能滿足診斷上皮惡性病變，目前ASCUS 僅提示有高級別病變及癌變的危險，因此需要一種對ASCUS 患者最好的分層處理方法。一種或多種高危型HPV 病毒持續性的感染可能會導致宮頸癌前病變的發展。高危型HPV 的檢測具有客觀、靈敏度高的特點。約70%～90%的HPV 陽性女性，可通過自身免疫清除感染。但是HPV DNA 檢測并不能區分患者是否持續性感染。HPV E6/E7 基因主要參與病毒 DNA 的復制、轉錄和凋亡等生理過程，參與腫瘤細胞的惡性生物學行為。病變的嚴重程度通常與每種HPV 類型中的E6 和E7 癌蛋白對靶蛋白的親和力有關：腫瘤抑制因子p53 和視網膜母細胞瘤蛋白。E6 和E7 癌蛋白還通過與細胞蛋白結合影響宿主細胞活性，是宿主宮頸上皮內瘤變發生所必需的。此外，在HPV 病毒感染初期，HPV DNA 處于游離狀態，由于HPV E2蛋白的作用，抑制E6 和E7 基因轉錄；當HPV DNA整合到宿主細胞上，E2 基因區被破壞，對E6 和E7基因的轉錄抑制消失，E6 和E7 癌蛋白大量表達。此外，Bruno 等的研究發現，HPV E6/E7 mRNA是疾病進展的極好標志物。因此，臨床上通過檢測HPV E6/E7 mRNA 的水平間接判斷患者是否為持續性感染，可良好規避HPV DNA 檢測引起的一過性感染的問題。本研究發現HPV DNA 對正常/慢性炎性反應及LSIL 的檢出率優于HPV E6/E7 mRNA，差異有統計學意義（=6.178，4.04，＜0.05）；HPV DNA及HPV E6/E7 mRNA 對HSIL+的檢出率無統計學意義（=1.053，＞0.05）。但是HPV E6/E7 mRNA 的特異性及陽性預測值優于HPV DNA 檢測，差異有統計學意義（＜0.05）。這與Ren 等的研究結果一致，認為HPV E6/E7 mRNA 分流ASCUS 患者特異性高，陽性預測值好，因此可作為篩查出高級別病變的更優方法，減少陰道鏡的轉診率，減少過度治療。

ASCUS 患者的HPV E6/E7 mRNA 的表達水平會隨宮頸病變的級別升高而升高，能有效預測疾病進展的風險。本研究結果顯示，由于E6 和E7 基因整合到宿主細胞，HPV E6/E7 mRNA 作為癌基因的直接表達產物，其陽性率會隨著宮頸病變級別的進展而升高。對其HPV E6/E7 mRNA 的拷貝值進行統計與分析，發現其拷貝值會隨著宮頸病變級別的進展而升高，對其陽性率及拷貝值行Spearman 秩相關分析，HPV E6/E7 mRNA 檢測的陽性率及拷貝值與宮頸病變級別呈正相關（=1.0，0.791，＜0.05），且各病變級別差異有統計學意義。王玲玲等按照病理結果進行分組，發現宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅱ組及宮頸癌組的病毒載量均高于CINⅠ組，且差異均有統計學意義，并且隨病變進展病毒載量隨之升高，與本研究結果有一致性。

進一步對ROC 曲線進行分析，發現HPV E6/E7 mRNA 病毒載量的AUC 值為0.941，大于HPV E6/E7 mRNA 定性的AUC 值0.735 及HPV DNA 的AUC值0.613，進而得出HPV E6/E7 mRNA 病毒載量及陽性率均比HPV DNA 的診斷HSIL+的效能高。因此，對于ASCUS 患者行HPV E6/E7 mRNA 檢測，若檢測結果為陽性，則考慮進行陰道鏡檢查，可有效降低陰道鏡轉診率。Ren 等、倪昌雪等和郭珍等研究對此也持有相同結果。但是本研究發現HPV E6/E7mRNA 病毒載量的AUC 值最大，這與上述研究者的結果略有不同，考慮可能進行HPV E6/E7 mRNA時，處于病毒復制活躍期，從而處于高拷貝狀態，因此得到得AUC 值最大，但是仍需大樣本數據進一步驗證該結論。

對符合隨訪條件且行隨訪的95 例患者1 年后行HPV 及TCT 檢測，上述檢查任意1 項陽性者行陰道鏡檢查及活檢，并將活檢病理結果與初次HPV DNA及HPV E6/E7 mRNA 結果進行對比，遂行ROC 曲線進行分析，發現HPV E6/E7 mRNA 的AUC 值為0.783，大于HPV DNA 的AUC 值0.658，因此發現HPV E6/ E7mRNA 還具有良好的預測高級別病變的效能。這與潘學景等研究結果高度一致。Pruski等的研究顯示，隨著年齡的增長，HPV E6/E7 mRNA 的敏感度和特異性更高，但是本研究未行年齡分層統計分析，郭珍等認為，HPV E6/E7 mRNA檢測在≥45 歲年齡組和＜45 歲年齡組中分流的敏感度均為100%，在≥45 歲年齡組中分流的特異性為79.0%（95%：73.7～83.5），比＜45 歲年齡組的特異性（68.3%，95%：53.0～80.4）高，差異無統計學意義（＞0.05）。因此是否考慮對年齡≥45 歲且HPV E6/E7 mRNA 結果為陽性的患者進行干預治療，延緩宮頸病變的進一步發展，仍有待商榷。

Brun等和Giorgi等的研究發現，HPV E6/E7 mRNA 陰性時，對HSIL 的消退具有極好的預測價值，而Brun 等在對HPV 陽性女性研究中發現，HPV E6/E7 mRNA 預測CINⅡ的消退率達到約60%。因此，對于ASCUS 患者HPV E6/E7 mRNA 結果為陰性的女性，無需進行進一步的陰道鏡檢查，做好隨訪工作，能夠減少高級別病變的漏診率，避免醫療資源的浪費。

綜上所述，對于ASCUS患者，可以根據其HPV E6/E7 mRNA 的結果進行可能發生的病變的初步評估，并根據其評估結果考慮是否行陰道鏡檢查，最后可根據患者的HPV E6/E7 mRNA 的結果有效預測發展為高級別病變的風險，建議HPV E6/E7 mRNA 可作為一種新的方法進行ASCUS 患者的分流，減少過度診療及漏診、誤診率，控制患者的疾病進展，指導臨床工作。