細菌對消毒劑耐藥的機制及交叉耐藥研究進展

毛鑫亮 許兆軍 朱夢雅

1.寧波大學醫學院附屬寧波市第二醫院，浙江寧波 315000；2.中國科學院大學寧波華美醫院，浙江寧波 315000

抗生素的發現與應用，使得很多以往被認為是致命性的感染相關性疾病得到了治愈，從而提高了人類的預期壽命。如今，由于醫療衛生、畜牧獸醫等多個領域對抗菌藥物的濫用和不合理使用，導致多種耐藥菌出現和播散，導致了感染相關性疾病的發病率和死亡率再次增加。然而，細菌耐藥現象并不局限于抗菌藥物。從Chaplin首次發現并報道細菌存在消毒劑耐藥性，到Qac、SMR 等消毒劑耐藥基因的證實與發現，越來越多的研究者開始認識到，與抗生素耐藥一樣，消毒劑對細菌存在耐藥現象。這種耐藥現象在雙胍類、醛類、季銨鹽類、酚類、碘類、醇類等多種消毒劑上均有所發現。本文基于國內外眾多學者的相關研究報道，歸納闡述消毒劑導致細菌耐藥的機制及交叉耐藥現象，為進一步的科學研究提供相關理論依據。

1 消毒劑耐藥的定義

目前存在多個關于細菌對消毒劑耐藥的描述與定義。普遍認為當常規濃度的消毒劑對細菌失去了本應具有的殺菌、抑菌能力時，即認為消毒劑產生了耐藥。亦有研究提出通過與標準菌株比較最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）或最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）來判斷細菌是否對消毒劑存在耐藥性。

2 消毒劑耐藥的判定與檢測方法

抗生素的耐藥性可通過采用MIC 聯合輔助紙片擴散法進行監測，通過國際標準進行耐藥分析。對于消毒劑，目前國內外尚無統一的耐藥定義標準，同時細菌對消毒劑敏感性的監測也無一致性評價方法。國內學者多采用MIC 或MBC 對比法來判斷耐藥性。隨著分子生物學的快速發展，國外學者多采用基因檢測來判斷細菌對消毒劑的耐藥性，目前發現的消毒劑抗性基因很少，如Qac、SMR 基因序列。國內多通過采用PCR 擴增檢測體系對國外報道的消毒劑耐藥基因進行相關檢測來進行耐藥分析。

3 消毒劑耐藥產生的原因和機制

3.1 耐藥產生的原因

醫院工作中需要廣泛使用消毒和滅菌等手段來預防和控制醫院感染。與抗生素濫用導致的耐藥一樣，消毒劑也發生了類似的耐藥現象。消毒方法不規范、有效濃度偏低或過高、作用時間不夠、不注意使用有效期、長期使用單一消毒劑等問題，均可導致細菌對消毒劑產生耐藥。

3.2 耐藥機制

消毒劑與抗生素均具有殺滅或抑制微生物的作用，在作用機制和耐藥機制上存在相似性。目前細菌對消毒劑耐藥的機制可分為固有耐藥（包括生物膜、細菌外部細胞層、主動外排系統、藥物降解酶等）、誘導性耐藥（包括生理適應、基因突變等）和獲得性耐藥（包括質粒、轉座子、整合子等）。通過以上一系列機制，消毒劑或被膜阻攔在外，或被酶滅活、修飾或排出，或細菌激活自身DNA 損傷誘導反應來修復和適應消毒劑的作用。

3.2.1 固有耐藥 ①生物膜：是微生物及其分泌物積累形成的聚集體。它們作為一個屏障，為微生物生命活動創造穩定的內部環境。生物膜通過限制消毒劑擴散的作用達到對消毒劑耐藥的效果。例如Akinbobola等發現在濃度為2000mg/kg的過氧乙酸處理下，內鏡腔內積聚的銅綠假單胞菌生物膜可存活96min，導致消毒劑失去效力。與單細胞細菌比較，生物膜在多種細菌中可起到協同作用，多種細菌的優勢菌株可以保護其他菌株免受消毒劑的侵害；與協同作用相反，某種病原體生物膜的形成也可能會受到其他細菌的抑制，Gutiérrez-Almada 等發現部分海洋細菌產生抑制了一種或多種菌株生物膜形成的物質。②細菌外部細胞層：無論是細胞壁還是細胞膜，它們都起著屏障保護的作用，阻止消毒劑的滲透。細胞壁和細胞膜滲透性的下降會降低或阻止消毒劑進入細菌。革蘭陰性菌因其細胞壁結構較為復雜，從而不易被消毒劑滲透破壞。③主動外排系統：目前已知有大量的膜蛋白參與了細菌對有害物質的外排，這些膜蛋白組成了主動外排系統。外排系統可能是細菌面對殺菌藥物威脅反應最快和最有效的耐藥機制。多個外排泵可共同，或與其他耐藥機制協同抵抗消毒劑的破壞。主動外排系統可分為5個膜蛋白家族，分別是耐藥瘤細胞分裂家族（resistance-nodulation-division family，RND）、主要易化子超家族（major facilitator superfamily，MFS）、多重藥物及毒物外排家族（multidrug and toxic compound extrusion family，MATE）、小多重耐藥家族（small multidrug resistance family，SMR）、ATP 結合盒家族（ATP binding cassette transporters，ABC）。其中，RND 最常見于革蘭陰性菌，如RND 家族中的TriABC 被發現于銅綠假單胞菌，是針對三氯生（triclosan，TCS）和十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）的特異性外排泵；家族中的甲基二乙醇胺[N-Ethyl-1-(3,4-methylenedioxyphenyl)-2-propylamine;methylenedioxyethylamphetamine，MDEA]可在葡萄球菌表達呈現，參與了季銨鹽類消毒劑外排。④藥物降解酶：細菌和殺菌劑的相互作用可使細菌產生具有降解殺菌劑作用的酶，這種抗性機制包括抗重金屬和抗甲醛等。此類耐藥基因可位于細菌不同部位，染色體內的基因與其固有性耐藥相關，亦可由誘導產生，質粒內的基因可通過傳遞而傳播。

3.2.2 誘導性耐藥 ①生理適應性耐藥：低濃度消毒劑的長期作用，可使細菌耐受性發生相應的變化。但這種耐藥性常發生在消毒劑濃度遠低于正常使用濃度時，而且其耐藥性是可逆的，往往隨著作用條件的去除而消失。②基因突變或耐藥基因表達增加：消毒劑及其他因素環境亦可提高細菌基因突變的發生率。其突變可發生在耐藥基因上，也可發生于控制耐藥基因的調控基因片段。③選擇壓力：嚴格意義上來講，選擇壓力并不是細菌個體層面上出現的誘導性耐藥。面對藥物選擇作用，細菌個體發生優勝劣汰，從而導致細菌群落對消毒劑的耐藥性整體增強。同時，消毒劑的使用不當或濫用均會加劇細菌耐藥性的發生。

3.2.3 獲得性耐藥 消毒劑耐藥基因的存在與表達決定了細菌對消毒劑的耐藥性。而這些耐藥基因按位置不同可分為兩類，分別由染色體和質粒介導。受體細菌通過各種途徑獲得其他細菌的耐藥基因引起的消毒劑耐藥即為獲得性耐藥，其中，質粒傳遞是其主要途徑。Qac 基因家族在消毒劑耐藥質粒的相關研究中較為常見，其又分為QacA、QacB、QacC、QacD、QacE、QacF、QacG、QacH、QacJ、QacZ 和Sugar（p）等多個亞型，表達多種化合物外排泵。QacA 或QacB 耐藥基因常見于葡萄球菌，最新研究發現攜帶QacA 的結合質?？梢詮母锾m陽性菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌轉移到革蘭陰性菌大腸桿菌C600 中，從而導致大腸桿菌對相應消毒劑的敏感性顯著降低。

其他途徑可見于轉座子和整合子。轉座子內的基因片段，可通過質粒傳遞或染色體呈現，或直接在菌株間轉移。整合子-基因盒系統可位于染色體，亦可出現在轉座子或質粒中，前者導致了子代的耐藥遺傳，后者引起細菌間的耐藥傳播。另外，耐藥基因還可通過噬菌體從一種細菌轉移到另一種細菌而發生耐藥性傳播。

4 消毒劑的交叉耐藥的定義與機制

國內外對微生物交叉耐藥的定義并沒有統一，交叉耐藥在國內一般泛指廣義的交叉耐藥，包含了國外學者的狹義交叉耐藥與共耐藥。狹義的交叉耐藥，是指屬于同一類的不同抗生素或抗菌藥物因為具有相同的耐藥機制而出現類似的耐藥；共耐藥是因為同一可移動基因元件（mobile genetic elements，MGES）如質粒、轉座子、整合子等攜帶對不同類抗菌藥物的耐藥基因，其發生突變或傳播時，不同作用機制的不同類藥物同時表現為耐藥；另外，即使抗菌藥物及消毒劑不屬于同一類，其各類耐藥機制也可能存在共通性。本文交叉耐藥為廣義交叉耐藥。

外排泵是引起交叉耐藥的常見機制。一種外排泵能排多個不同類型的抗菌化合物，這致使細菌在各類抗菌化合物之間產生交叉耐藥。目前發現了多種同時引起消毒劑和抗生素耐藥的外排泵系統。染色體上和質粒都可能存在這類耐藥基因。以金黃色葡萄球菌為例，其染色體基因編碼的家族外排泵NorA，在外排喹諾酮類抗生素的同時，也能外排季銨鹽類消毒劑。其質粒介導的耐藥基因Qac，各亞型可以編碼產生不同外排系統家族的外排蛋白。研究發現相較非耐藥菌株，頭孢西丁、環丙沙星和四環素等耐藥菌株的Qac 基因明顯增高，可能與多種耐藥基因位于同一個質粒上產生共耐藥相關。

另外，由于菌株或者群落具有特殊的屏障結構，如生物膜、外膜蛋白為細菌提供了額外的保護，或細胞壁和細胞膜發生了結構功能上的改變導致通透性下降，這些非特異性抗藥都是產生交叉耐藥的重要原因。相較于游離菌，有生物膜存在的細菌，其耐藥基因的表達會明顯升高。

同時，國內外對消毒劑與抗生素耐藥性的關聯性方面亦存在不同看法及報道。Roedel 等對食品生產設備中分離得到的單核細胞增生李斯特菌株進行消毒劑和抗生素敏感性的檢測，并未發現兩者耐藥性方面存在關聯性。

5 小結與展望

細菌具有很強的適應能力，可以隨著環境變化及抗生素、消毒劑的廣泛運用，通過上述系列機制不斷發生進化。而這種進化使得細菌對抗生素及消毒劑產生了耐藥及交叉耐藥，導致臨床工作所面臨的挑戰更具復雜性?，F今普遍認為，消毒劑的濫用、處理不當以及用量不足等是導致上訴耐藥現象的主要原因。

目前，國內外對消毒劑種類的研究有限，所選細菌的代表性不夠強，其耐藥產生的機制尚未研究透徹，對消毒劑耐藥性的判定也未統一建立。上述問題都將成為進一步研究及標準建立的重點。目前研究的消毒劑種類多集中在物體表面消毒劑，此類消毒劑可通過浸泡、擦拭、噴灑等多種方式作用于家庭或醫療場地等公共環境物體表面。其理化性質及藥物濃度對人體存在危害性，如何選擇合適的皮膚或創面醫用消毒劑作為研究用藥對象，將更具臨床意義。加強細菌對消毒劑耐藥性機制及交叉耐藥的研究，如通過進一步的試驗設計，研究比較抗生素耐藥菌株與非耐藥菌株對特定消毒劑耐藥性的差別，了解消毒劑與抗生素耐藥相關程度。隨著研究的深入及數據的支持，與抗生素耐藥檢測與判讀一樣，消毒劑耐藥性的檢測與判定也將建立起統一的標準方案，進而為消毒劑及抗生素的臨床合理選擇提供更全面的思路與依據，同時還可以為新型消毒劑的研發提供相應理論支持。